Kombinierte optogenetische und Gefrierbruch Replica Immunmarkierung Eingang spezifische Anordnung der Glutamate Receptors in der Maus Amygdala zu untersuchen

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden vom Regierungspräsidium Tübingen, Bundesland Baden-Württemberg, Deutschland, und von der Österreichischen Tierversuche Ethikrat und wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung genehmigt. 1. Stereotaktische Injektionen von AAV-Channelrhodopsin2-YFP HINWEIS: Stereotactic Injektionen wurden nach durchgeführt zu einem zuvor veröffentlichten Protokoll 20. Bereiten Sie sterile Werkzeuge, indem sie bei 180 ° C für 1,5 Stunden erhitzt. Ziehen Sie scharf (~ 50 & mgr; m Durchmesser) Glaspipetten für Injektionen eine horizontale Mikroelektroden-Abzieher-Set mit den folgenden Parametern: Wärme = Rampenwert – 20, Pull = 0, Geschwindigkeit = 100, Time = 200, Druck = 200. HINWEIS: Rampenwert muss für jede Menge gekauft Glaspipetten bestimmt werden gemäß den Anweisungen von der Mikropipette Abzieher Hersteller zur Verfügung gestellt. Premix 1 ul Viruslösung und 0,2 ul 0,1% Fast Green-Lösung (für eine bessere Sichtbarkeit der Lösung in der Glaspipette) in sterile Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS; 25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4). Füllen Sie die Glaspipette mit einer 10 & mgr; l-Pipette und Gel-fil Tipps. Für das virale Konstrukt verwenden rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (Serotyp 2/9). Anesthetize Maus ein kleines Tier Anästhesiegerät (3% Isofluran in Sauerstoff für Induktion) verwendet wird. Benutzen. Für diese Studie verwenden 3 Wildtyp-Mäusen im Alter von ~ 6 Wochen. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen und desinfizieren mit einem PVP-Jod-basierte Lösung. Tragen Sie eine Augensalbe zum Austrocknen der Augen während der Narkose zu verhindern. Subkutan injizieren Maus mit analgetischen (Meloxicam-basierte, 0,1 ml einer 5 mg / ml Lösung). Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen und halten Anästhesie über eine Gasanästhesiegerät (2% Isofluran in Sauerstoff für die Wartung). Überprüfen Narkose Tiefe durch das Fehlen eines Gliedes RückzugReflex, bevor Sie fortfahren. Pflegen sterilen Bedingungen so gut wie möglich während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Tragen Sie eine Einweg-Gesichtsmaske, einen OP-Kittel und Handschuhe. Machen Sie einen Hautschnitt von ca. 1 cm auf der Oberseite des Kopfes mit einer Schere 20. Ziehen Sie die Haut an der Seite stumpfen Pinzette, fix mit Klammern Schädeloberfläche und sauber Schädel mit H 2 O 2 zu belichten. Mark Injektionsstellen auf dem Schädel eine feine Spitze Permanentmarker verwenden. Bohren Sie ein kleines Loch (ca. 1 mm Durchmesser) in den Schädel an der markierten Stelle. Für einseitige PIN / MGn Injektion in diesem Gestüt, verwenden Sie die folgenden Koordinaten: von Bregma (mm): posterior 3,0, lateral ± 1,8, ventralen 3.8. Berg gefüllt Glaspipette auf stereotaktischen Rahmen verbunden mit einer Druckeinspritzvorrichtung und bringen die Pipettenposition Bregma. Brechen Sie die Spitze der Glaspipette mit feiner gerader Spitze Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze ist offen von applyinga wenige Druckimpulse und die Beobachtung der Extrusion von Tropfen Virus-Lösung. Gehen Sie zu den gewünschten Injektions Koordinaten und injizieren die Hälfte der Pipetteninhalt (~ 0,5 ul) mit den folgenden Einstellungen auf der Druckinjektionsvorrichtung: Druck 20 psi, mittlere Pulslänge 30 ms, die durchschnittliche Anzahl von Impulsen 50. Lassen Sie Pipette in Platz für ca. 1 min, bevor sie langsam (1 mm / min) zurückgezogen wird es. Saubere Schädel mit PBS (pH 7,4) und Klemmen entfernen. Ziehen Sie die Haut zusammen, und vernähen den Einschnitt (3-4 Knoten). Desinfektionsmittel anwenden (Povidon-Iod bezogen) um die Wunde. Stoppen Sie die Anästhesie und lassen die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig wach. Halten Mäuse einzeln untergebracht. Postoperativ weiterhin um den Gesundheitszustand zu überwachen; ggf. verabreichen Analgetikum. Halten Sie Tiere für 4 Wochen vor dem Gehirn Fixierung auf ein angemessenes Maß an viralen Expression gewährleisten. 2. Probenvorbereitung Gehirn – Fixierung </Strong> Herstellung des Fixiermittels Für 1 l Fixiermittel, 10 g Paraformaldehyd wiegen und fügen Sie ihn in 300 ml entsalztem H 2 O. Hitze auf 55-60 ° C für ~ 10 min unter ständigem Rühren. Schalten Sie die Hitze und fügen Sie 7 – 8 Tropfen 4 N NaOH. Die Lösung sollte klar in ~ 10 min werden. Lassen Sie es auf RT abkühlen, 150 ml einer gesättigten Lösung von Pikrinsäure hinzufügen und bringen es auf 500 ml mit entionisiertem H 2 O Hinzufügen 500 ml 0,2 M Phosphatpuffer (PB). Filter mit Filterpapier. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Kühlen Sie die Fixiermittel bis 6 ºC, lagern Sie es in dunklen Glasflaschen für nicht mehr als einen Tag lang bei 6 ºC. Transcardiac Perfusion Anästhesieren Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Thiopental (120 mg / kg Körpergewicht). Stellen Sie sicher, dass das Tier tief durch Überprüfung des Pedals Rückzug refl narkotisiertex, die abwesend sein sollte. Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer Perfusions-Tabelle mit den vier Extremitäten gebunden. Öffnen Sie die Bauchwand in Längsrichtung mit stumpfen Enden Schere und machen zwei zusätzliche Schnitte seitlich entlang der kaudalen Rand des Brustkorbs, um die Membran aus. Schneiden Sie die Membran entfernt und schneiden Sie die Brustwand an der osteocartilageneous Grenze auf beiden Seiten. Heben Sie das Schwanzende des zentralen Platte von Brustwand des Brustbeins mit dem Herz zu belichten. Entfernen Sie die Herzbeutel, machen einen kleinen präzisen Schnitt in der Spitze des linken Ventrikels die Kanüle der Perfusionsgerät zugeben. Verwenden Sie einen stumpfen Kanüle mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm. Übergeben Sie die Kanüle sanft durch die Ventrikel, bis die Spitze die aufsteigende Aorta erscheint in und sichern Sie die Kanüle mit einer Klemme. Um das Blut und perfusates, um aus dem Blutstrom zu ermöglichen, einen Schnitt im rechten Vorhof machen. Perfuse Mäusen transkardial einer peristaltischen Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeitvon 5 ml / min zunächst mit PBS (25 mM, 0,9% NaCl, pH 7,4) für etwa 1 min, gefolgt von eisgekühltem Fixiermittel für 7 min. mit der Maus den Kopf mit einer Schere Nach der Fixierung durchtrennen und dann schneiden Sie die Haut durch die Mittellinie vom Hals bis zur Nase. Entfernen Sie den Muskel vollständig den Schädel freizulegen. Mit einer scharfen Schere, machen einen Längsschnitt durch den Hinterhaupts und interparietal Knochen aus dem Foramen magnum beginnen. Mit einer feinen Pinzette diese Knochen entfernen Sie das ganze Kleinhirns zu belichten. Dann machen Sie einen weiteren Längsschnitt durch die parietalen und frontalen Knochen bis zum Nasenbein und entfernen Sie sie mit einer Pinzette das ganze Gehirn aufzudecken. Spachtel Mit dem Gehirn zu entfernen, ohne es zu beschädigen, und es in eiskaltem 0,1 M PB schalten. Sectioning und Beschneiden der Proben Schneiden Sie einen koronalen Block von ca. 5 – 6 mm mit Rasierklingen den Bereich von Interesse enthält. Kleben Sie es auf den Inhaberdie vibroslicer mit einem Sekundenkleber. Richten Sie den Gewebeblock, so dass der Neokortex die vibrierender Klinge zugewandt ist. Scheibe Koronalschnitte, enthält die Amygdala, bei 140 & mgr; m mit dem vibroslicer (1A) in eiskaltem 0,1 M PB, und sammeln sie in einem 6-Well – Platte in dem gleichen Puffer. Unter einem Stereomikroskop, um die Region von Interesse trimmen (hier die medio-dorsale paracapsular Cluster in der ITC, siehe Abbildung 1B) von der Scheibe. Dies geschieht in einer Petrischale, beschichtet mit Silikonelastomer und gefüllt mit 0,1 M PB, eine ophthalmische Skalpell. Stellen Sie sicher , dass die zugeschnittenen Blöcke in das Loch des Abstandshalters passen (ca. 1,5 mm) (1B). Verschieben Sie die getrimmten Blöcke in Kryokonservierung-Lösung (30% Glycerin in 0,1 M PB) O / N bei 6 ºC. 3. Hochdruck Freezing HINWEIS: Die FRIL besteht aus 6 wesentlichen Schritte (Abbildung 2): 1) Schockgefrieren mit hohem Druck (bei 2.300 – 2.600 bar) der Probe. 2) Fracturing der Probe. Die Bruchebene folgt im allgemeinen den zentralen hydrophoben Kern von gefrorenen Membranen, um sie in zwei Halbmembran Blättchen Aufspalten: eine Hälfte, die dem Plasma (P-face) benachbart liegt und eine Hälfte, die an die extrazelluläre oder exoplasmic Raum benachbart liegt (E- Gesicht). 3) Die Replikation der Probe durch Vakuum-Abscheidung von Platin und Kohlenstoff. 4) Detergent-Verdauung des Gewebes. 5) Immunogoldmarkierung. 6) Analyse der Nachbildung ein Transmissionselektronenmikroskop. Herstellung von Kupferträger ANMERKUNG: Um durch die aufeinanderfolgenden Stufen des FRIL Verfahren behandelt werden, müssen Proben auf Metall (Gold oder Kupfer) Träger montiert. Diese Träger variieren in Größe und Form entsprechend dem Modus des Brechens und der Art der Maschinen. Hier verwendeten wir Kupferträger (1B, E) und einem aufklappbaren "double Nachbildungstabelle"; (siehe Abbildung 3B), die beim Öffnen einen Zug – Bruch durch die gefrorene Probe erzeugt (Abbildung 2). Dies ermöglicht es, beide Seiten der gebrochenen Probe zu erhalten und zu replizieren. Polnischen Kupferträger mit Beschlägen Entferner ein Blatt Gämse Haut verwenden. Platz Träger in einem Glastopf und sauber zweimal mit einem nicht-ionischen Detergens (pH ~ 1,5) in einem Beschallen Wasserbad, dann waschen Sie ausgiebig in Leitungswasser, gefolgt von entsalztem Wasser und dann spülen zweimal mit Ethanol. Beschallen die Kupferträger in Aceton für 15 min. Legen Sie die Träger auf Filterpapier trocknen. Bringen Sie einen Ring von doppelseitigen Klebeband auf einen Kupferträger (1C), die als die Halte gut für den getrimmten Block (Halteträger) dienen. Das Einfrieren der Probe HINWEIS: Die beim Umgang mit flüssigem Stickstoff mit Sorgfalt und tragen eine geeignete Schutzbrille. Schalten Sie den Hochdruck freiZing Einheit (1F) mindestens 1,5 Stunden vor dem Muster Einfrieren beginnen. Starten Sie Heizung durch die "LUFTERHITZER" Taste drücken, und backen Sie heraus für 50 min. Eingestellt Lufttemperatur auf 80 ° C. Schließen Sie den Stickstofftank an der Hochdruckgefriereinheit und drücken Sie die "nitrogen", um das Innere Dewar mit flüssigem Stickstoff zu füllen. Die "nitrogen LEVEL" leuchtet. Starten Kühlung durch die "Kühlung" Taste drücken. Drücken Sie die "DRIVE IN" Taste, wenn die "nitrogen LEVEL" erlischt. Überprüfen Sie, ob das Hydrauliksystem den Kolben hin und her 3-mal bewegt. Drücken Sie die Taste "AUTO" und die "nitrogen" -Taste. Sobald "READY" leuchtet, ist der Hochdruckgefriereinheit für Hochdruck-Gefrieren bereit. Platzieren eines getrimmten Block in das Loch des doppelseitigen Klebebandes (1B) unter Verwendung eines Platindrahtschleife , die in ag geschmolzen wurdelass Pipette. Entfernen Sie den Überschuss der Cryoschutzstofflösung mit Filterpapier oder einer Bürste. Hinweis: Dieses Verfahren ist auch wichtig, um Luftblasen zu entfernen, um das Gewebe bilden können und die Verzerrung der Gewebeform und / oder Ultrastruktur führen könnte. Unter einem Stereomikroskop, decken den Halteträger mit einem anderen Träger, so daß der Gewebeblock zwischen den beiden Trägern angeordnet ist. Setzen Sie den Träger-Sandwich in den Probenhalter des Hochdruckgefriereinheit (1D). Setzen Sie den Probenhalter in den Hochdruckgefriereinheit (Spitze nach unten) und befestigen Sie ihn in den Probenhalter durch Verschrauben. Starten Sie den Gefrierzyklus durch die "Jet-Auto" -Taste drücken. Arbeiten so schnell wie möglich, entfernen Sie den Probenhalter und versenken die Spitze mit flüssigem Stickstoff in einem isolierten Kasten. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Zangenpaaren in den flüssigen Stickstoff, um sie abzukühlen. Entfernen Sie vorsichtig the Carrier-Sandwich aus dem Probenhalter und legen Sie sie in ein vorgekühltes Cryovial. Stellen Sie sicher, dass die Träger nur mit flüssigem Stickstoff gekühlten Zange behandelt werden. Kryoröhrchen sollte der Stickstoff strömt aus dem Fläschchen (1G) zu ermöglichen , perforiert werden. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 bis 3.2.11, bis alle gewünschten Proben eingefroren wurden. Mehrfachträger-Sandwiches die gleiche Art der Probe enthalten, können in der gleichen Phiole gelagert werden. Bewahren Sie die Kryovials die Träger in einem Kryotank , bis die Replikation (Abbildung 1H) enthält. Abbildung 1. Gewebepräparation und Hochdruck – Freezing. (A) Vibroslicer Abschnitt verwendet , um das Gewebe.   (B) Eine resultierende koronalen Mausgehirn Abschnitt die Amygdala gezeigt nebeneinander mit AC enthältopper Träger mit einem Ring von doppelseitigen Klebeband versehen. Die gestrichelte Box zeigt den Bereich von Interesse, dass die mediale paracapsular Cluster des ITC enthält. Der Durchmesser des Lochs in dem doppelseitigen Klebeband beträgt etwa 1,5 mm. (C) Werkzeuge zur Herstellung von Kupferträger. Von oben links im Uhrzeigersinn: doppelseitiges Klebeband, Pinzette, Puncher, Kupfer Träger, und eine Schere. (D) Einsetzen des Träger-Sandwich in den Probenhalter für Hochdruck – Gefrieren. Der Träger-Sandwich wird in die Öffnung des Probenhalters angeordnet. (E) Kupferträger ohne und mit einem Ring von doppelseitigen Klebeband und der "Träger-Sandwich".   (F) Hochdruckgefriereinheit mit unter Druck stehenden Behälter mit flüssigem Stickstoff , um es füttern. (G) A Cryovial die gefrorenen Gewebe auf Lager. Beachten Sie die Löcher in der oberen Mittelposition des Fläschchens ermöglicht Stickstoffgas aus dem Fläschchen (Pfeilspitze) zu fließen. <strong> (H) Kryotank das gefrorene Gewebe zu speichern. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Gefrierbruch und Replikation Herstellung der Elektronenstrahlkanonen Vor dem Einsetzen der Elektronenstrahlkanonen, entfernen Sie das Schild mit dem "Leitblech". Setzen Sie die "Einstellehre" zur Zentrierung des Fadens in die Spannzange durch die untere Kathodenabdeckung. HINWEIS: Der größere Durchmesser Ende der Einstellehre ist für die Kohlenstoffpistole verwendet, während das Ende mit kleinerem Durchmesser für die Platin-gun ist. Schieben Sie den neuen Faden über die Lehre, bis "der Druckplättchen" können die Enden des Fadens klemmen, um sicherzustellen, dass die Glühwendel nicht in einem Winkel liegt. Entfernen Sie die Einstellehre und legen Sie die Kohlestab. Fix it durch die Co Anziehenllet chuck des Verdampfers Stangenhalters, so dass die Höhe des Endes der Stange in der Mitte der zweiten Spule von der Unterseite ist. Für die Platin gun, sollte die Höhe des Endes des Platinstab in der Mitte der zweiten Glühwendel von oben sein. Ersetzen Sie die Ablenkplatte und legen Sie mit Gewehren in die Gefrierbrucheinheit. Reinigen Sie die Geschütze mit einem Sand-Blaster nach Gebrauch. Abbildung 2. Darstellung der wichtigsten Schritte der FRIL – Technik. Überblick über die verschiedenen Schritte zur Herstellung und Analyse von Replikat erforderlich. (1) Hochdruck-Gefrieren von Gewebe. (2) Fracturing. Während des gefrorenen Gewebes Fracturing wird die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran in zwei Hälften an der hydrophoben Grenzfläche. Proteine, die in der Plasmamembran zugeordnet sind entweder auf dem exoplasmic (E-face) oder protoplasmic Membranen (P-face). (3) Die Replikation. Die Verdampfung von Kohlenstoff (C) auffängt Lipide und Proteine ​​auf der Oberfläche des gebrochenen Gewebes. Das Material wird mit 2 nm Platin / Kohlenstoff beschichtet bei einem 60 ° -Winkel Abschattung und dann mit einer weiteren 15 nm Kohlenstoffschicht, welche die Struktur der Replik (C-Schicht, Pt-Shadowing) stärkt. (4) Solubilisierung. Das Gewebe nicht durch die Replik Membran eingeschlossen wird dann mit SDS-Lösung in Lösung gebracht. (5) Labeling. Proteine ​​von Interesse können auf Replik sichtbar gemacht werden mit Hilfe eines komplexen aus spezifischen primären Antikörpern (Primary Ab) und Sekundärantikörper (Secondary Ab), konjugiert mit einem Goldpartikel (Au). Die Verwendung unterschiedlicher Größen von Goldpartikeln ermöglicht den Nachweis von mehr als einem Protein auf der gleichen Replik. (6) Nach der Immunmarkierung, Repliken werden auf Kupfermaschengittern gesammelt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 analysiert -. 100 kV Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. Stellen Sie das Gerät von Gefrierbruch Schalten Sie das Gefrierbrucheinheit (3A) durch NETZ zu 1. Für eine detaillierte Beschreibung der Gefrierbruch und Replikationsverfahren Drehen, siehe Betriebsanleitung des Herstellers. Vor dem Abkühlen des Gefrierbruch-Vorrichtung, backen das gesamte Kühlsystem des Gerätes mit Warmluft aus. Drücken Sie die "auftauen" -Taste in der MTC 010 – Gerät (Temperatursteuerungseinheit) (3A) und lassen Sie den Auflauf aus Prozessdurchlauf für 45 min. Aktivieren Sie die Vakuumstation. Die Gefrierbrucheinheit arbeitet in der Regel in einem Vakuumbereich von ~ 10 -6 – 10 -7 mbar. Füllen Stickstofftank und schließen Sie es an der Gefrierbrucheinheit. Überprüfen Sie, ob der Ventilhalter trocken und sauber ist auch die Eingabe des Tanks vor dem Einsetzen des Ventilhalters (Feuchtigkeit kann stören VACUUm und Anzeige von N 2 Befüllung des Tanks). Beginnen Kühlung durch die Temperatur auf -115 ° C einstellen. Die Kühlung dauert etwa 45 min. Legen Sie die Elektronenstrahlkanonen und stellen Strom und Spannung die folgenden Parameter für die Verdampfung zu erreichen: Carbon-Pistole: Drehung auf, Position 90 °, Geschwindigkeit der Kohlenstoffansammlung 0.1 – 0.2 nm / s Kohlenstoff-Platin-Pistole: Drehung ab, Position 60 °, Akkumulationsrate von 0,06 bis 0,1 nm / s HINWEIS: Wenn eine Waffe zum ersten Mal nach dem Austausch des Kohlenstoff oder Platinstab, Entgasen für 3 Minuten vor dem Gebrauch verwendet wird. Fracturing und Replikation Legen Sie gefrorene Träger-Sandwiches in Doppel Replikattabelle sicherstellen, dass alle Manipulationen in flüssigem Stickstoff durchgeführt werden. Übertragen Doppel Replik Tisch zu einem Dewar-Gefäß und befestigen Sie es mit dem Probentisch Empfänger in einem Winkel von 45 °. Der flüssige Stickstoff Ebene sollte immer über dem Doppel Replik Tabelle sein. </li> Suchen Sie sich die Doppel-Replik-Tabelle mit dem Tabellen Manipulator und legen Sie sie in die Gefrierbrucheinheit auf dem kalten Stadium. Wartezeit von ca. 20 min die Temperatur des Doppelnachbildungstabelle zu ermöglichen, bis -115 ° C einzustellen. Überprüfen Sie, ob das Vakuum unter 10 -6 mbar und die Temperatur -115 ° C. Bruch des Gewebes durch manuelle Drehung gegen den Uhrzeigersinn des Rads an der Haube über dem Doppel replica Tisch verbunden ist. Wenn die Verkleidung dreht, zwingt es die doppelte Replik Tabelle zu öffnen, um das Gewebe zu brechen. Drücken Sie die "Hochspannung" in der EVM 030 Gerät (Elektronenstrahlverdampfungssteuereinheit) der Gefrierbrucheinheit (3A). Replizieren der freiliegenden Oberflächen des gebrochenen Gewebes (3C) durch Verdampfung von Kohlenstoff (rotierend) mittels einer Elektronenstrahlkanone in einem 90 ° -Winkel zu einer Dicke von 5 nm positioniert, gefolgt von einer unidirektionalen shadoFlügel mit einer Platin-Kohlenstoff bei einem Winkel von 60º zu einer Dicke von 2 nm. Schließlich eine 15 nm dicke Schicht aus Kohlenstoff, der aus einem 90 ° Winkel (rotierend) gelten. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Verdunstung: 1. Kohlenstoff: Drehung auf, Position 90 °; Geschwindigkeit 0,1 bis 0,2 nm / sec; 5 nm 2. Kohlenstoff-Platin: Position 60 °; Geschwindigkeit von 0,06 bis 0,1 nm / sec; 2 nm 3. Kohlenstoff: Drehung auf, Position 90 °; Geschwindigkeit von 0,3 bis 0,5 nm / s; 15 nm Entfernen Sie die replizierten Proben aus dem Gefrierbrucheinheit und sie auf einem keramischen 12-Well – Platte (4A) , gefüllt mit TBS (Tris – gepufferte Salzlösung, pH 7,4). Unter Verwendung einer Platinöse Gießwalzdraht, entfernen Sie das replizierte Gewebe aus dem Probenträger (4A). Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.10, bis alle Proben repliziert wurden. <b r /> Abbildung 3. Die Gefriert Fracturing und Replikation. (A) Das Gerät Gefrierbruch. Die Maschine enthält mehrere Steuergeräte und einen Monitor. Proben werden in die Kammer durch eine Öffnung auf der linken Seite der Kammer eingeführt. Ein unter Druck stehendes Flüssigstickstoffbehälter ist mit dem Gefrierbrucheinheit verbunden, um die Stufe zu kühlen. Bilder unten zeigen vergrößerte Ansichten von zwei der Einheiten (UPC 010 und MDC 010) und der Monitorparameter beim Verdampfen der zweiten Kohlenstoffschicht anzeigt.   (B) Eröffnet (links) und geschlossen (rechts) Blick auf die Doppel – Replik – Tabelle. Die "Carrier-Sandwiches" in die Schlitze der Tabelle eingefügt (durch Pfeile). Die Kleinwaffen verhindern "Träger-Sandwiches" aus während der Manipulation herausfallen. (C) A gebrochen und repliziert Probe. Replicas erscheinen als dünne schwarze Filme auf der Oberseite des gebrochenen Gewebes.53 / 53853fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. SDS-Verdauung der Replik Transfer Replik auf eine 4 ml-Glasfläschchen, gefüllt mit 1 ml SDS-Verdauungspuffer (2,5% Natriumlaurylsulfat, 20% Saccharose in 15 mM Tris, pH 8,3). Digest für 18 Stunden bei 80 ° C unter Schütteln (45 Hub / min). Transfer Repliken in ein neues Röhrchen gefüllt mit SDS-Verdauungspuffer und lagern bei RT. 5. Immunmarkierung HINWEIS: Alle Inkubationen werden bei RT unter leichtem Schütteln durchgeführt, mit Ausnahme von Inkubationen mit Antikörpern. Waschen Sie die Replik für 10 Minuten in frischem SDS-Verdauungspuffer. Waschen Sie die Replik einmal mit 2,5% BSA (Rinderserumalbumin) in TBS für 5 min und dann 3 x 10 min mit 0,1% BSA in TBS. Block nicht-spezifische Bindungsstellen in TBS mit 5% BSA für 1 Std. Bewerben primären AntiKörper in 2% BSA-TBS verdünnt. Führen Inkubationen in einem 30 ul Tropfen (4B) in einer feuchten Kammer bei 15 ° C für 72 Stunden (4C). Für diese Studie Prozess sowohl Repliken aus dem gebrochenen Gewebe. Inkubieren einer Replik mit einem Meerschweinchen polyklonalen Antikörper gegen die Aminosäuren 717-754 des Maus-GluR1 gemeinsam für alle AMPA-R-Untereinheiten (Verdünnung: 1: 200) oder einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen ein rekombinantes Fusionsprotein erhöht abdeckt Aminosäuren 660 – 811 der NR1-Untereinheit des NMDA-R (Verdünnung: 1: 500), und einem polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das grün fluoreszierende Protein erhöht (Verdünnung: 1: 300). Inkubiere die andere Replik mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen ein synthetisches Peptid gerichtet entsprechenden Säuren 384 bis Aminosäure – 398 der Ratten-μ-Opioid-Rezeptor (Verdünnung: 1: 500). Waschen in TBS mit 0,05% BSA (3 x 5 min.). Bewerben Sekundärantikörper. Für diese Studie use Gold (5 nm für ionotrope Glutamatrezeptoren, 10 für μ-Opioid-Rezeptoren und / oder 15 nm für ChR2-YFP) konjugierten Antikörper verdünnt in TBS mit 2% BSA. Verdünnen Sekundärantikörper 01.30 und Inkubation in einem 30 ul Tropfen bei 15 ° CO / N. Waschen 3 x 5 min in 0,05% BSA-TBS bei RT. Waschen 2 x 5 min in Reinstwasser. Berg Replik auf Formvar beschichtetes 100-Linie , die parallel bar Gitter (4D). 6. Replica Analyse Bild Repliken mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bei 80 oder 100 kV. Erwerben Sie digitale Bilder durch eine CCD (charged coupled device) Kamera. Offline finden Regionen auf die Bilder von beiden Repliken entsprechenden Verwendung Sehenswürdigkeiten (4E). Analysieren digitalen Bild J. Bestimmen postsynaptischen Bereich und die Anzahl der Immunogold-markierten Teilchen gegen den Rezeptor analysiert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Abbildung 4. Immunmarkierung von Replica. (A) Werkzeuge zum Bearbeiten und Waschen der Repliken. Ein Keramik-12-Well-Platte (oben rechts) und 2 Arten von Glaspipetten (oben links). Die Glaspipette mit runder Spitze (unten links) wird verwendet, Replik zu übertragen, und die Pipette mit Platinstab (unten Mitte) wird verwendet, Repliken zu entfalten. Eine Replik in Waschpuffer (unten rechts). (B) Immunmarkierung von Repliken in Tropfen durchgeführt (30 & mgr; l) , die auf einem kleinen Stück Parafilm in einer Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well – Platte. Beachten Sie, dass eine Replik von einem Tropfen Puffer, der Antikörper bedeckt ist. Um zu verhindern, Verdampfung, einem angefeuchteten Stück Seidenpapier ist um den inneren Rand des Bohrlochs ausgestattet. (C) Inkubator für die Immunmarkierung Schritt. Inkubationen werden bei 15ºC durchgeführt. (D) Eine Replik montiert auf ein Formvar beschichteten 100-Linie parallel bar-Netz. (E) geringer Vergrößerung Mikroskopische Aufnahmen von einem Paar von Repliken. Die gepunkteten Quadrate zeigen drei typische Sehenswürdigkeiten einen Ort in den entsprechenden Repliken zu identifizieren. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur.