结合光遗传学和冷冻断裂免疫标记副本研究在老鼠杏仁核谷氨酸受体的特定投入安排

涉及动物主题手续已经批准Regierungspraesidium蒂宾​​根，巴登 – 符腾堡州，德国国家元首和由奥地利动物实验伦理委员会，并分别按照在研究中使用动物的欧盟指令。 1，AAV-Channelrhodopsin2-YFP的立体定向注射注：立体定向注射是根据以前发表的协议20进行。 通过在180ºC它们加热1.5小时制备无菌的工具。 拉尖锐（〜直径50微米）玻璃吸管用于使用水平微电极拉出器具有以下参数设定注射：热=斜坡值 – 20，拉= 0，速度= 100，时间= 200，压力= 200。 注：斜坡的价值需要根据由微量拉马制造商提供的说明，每批购买的玻璃吸管来确定。 预混物的病毒溶液1微升和0.2微升的0.1％快速绿色溶液（在玻璃吸管将溶液的更好的可视性）在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS; 25mM的，0.9％氯化钠，pH值7.4）。通过使用10微升吸管和凝胶-FIL提示填充玻璃吸管。对于病毒构建，使用腺相关病毒hSyn-的ChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）。 用小动物麻醉设备（氧气诱导3％异氟烷）麻醉鼠标。使用。在这项研究中，使用年龄〜6周3野生型小鼠。 耳朵和眼睛之间剃头和带碘伏基于溶液消毒。 应用眼药膏，以防止在麻醉过程中眼睛干燥。皮下注入小鼠具有止痛（美洛昔康为主，0.1毫升5毫克/毫升溶液）。 将鼠标在立体框架，并通过气体麻醉设备（氧气2％异氟醚用于维护）维持麻醉。由于缺乏肢体撤回检查麻醉深度继续之前反射。 在整个手术过程中保持无菌条件尽可能最好。戴上一次性面罩，一个手术衣和手套。 使使用剪刀20的头部的顶约1cm皮肤切口。轻轻拉动皮肤使用钝钳一边，用夹子固定修复暴露颅骨表面，清洁头骨与H 2 O 2。 用细尖记号笔在骷髅标记注射部位。钻一小孔（大约1毫米的直径）为在标记位点的头骨。对于单边PIN / MGN注射该螺栓，使用下列坐标：从囟（毫米）：3.0后，横向±1.8，腹面3.8。 安装填充玻璃吸管上连接到压力注射装置立体定位框架，并把吸移管到前囟的位置。 断绝用细直尖镊子玻璃吸管的尖端。确保枪头是applyin开放GA几个压力脉冲和病毒液滴观察挤压。 转至所需的注射坐标和使用注射压力注射设备上进行以下设置移液器的内容（约0.5微升）的一半：20压磅，平均脉冲宽度30毫秒脉冲50的平均数量。 离开吸管到位慢（1mm /分钟）之前缩回它〜1分钟。 清洁头骨PBS（pH 7.4）中，取出夹子。轻轻拉动皮肤在一起，缝合切口（3 – 4节）。伤口周围施加消毒剂（基于聚维酮碘）。 停止麻醉，不要离开鼠标，直到无人看管完全清醒。养老鼠单住。术后继续监测健康状况;如有必要，辖止痛。 饲养动物4周脑固定前，以确保病毒表达的适当水平。 2.试样制备 脑固定</STRONG> 固定剂的制备 为1升的固定剂的，称取多聚甲醛，并把它添加到300毫升去离子H 2 O的热火以55 – 60ºC为〜10分钟，并不断搅拌。 关闭加热并添加7 – 4 N氢氧化钠8滴。该解决方案应该成为〜10分钟清楚。 让其冷却至室温，添加的苦味酸饱和溶液150毫升，并与去离子H 2 O带来至500ml 加入500毫升0.2M的磷酸盐缓冲液（PB）的。用滤纸过滤。调节pH至7.4，用NaOH。 冷却该固定剂6ºC，它在6ºC存储在黑暗玻璃瓶不超过一天。 Transcardiac灌注 麻醉小鼠硫喷妥钠（120毫克/公斤体重）的腹膜内注射。确保动物深受检查踏板撤出REFL麻醉当然，应不存在。将动物在其上灌注表背与四肢捆绑住。 用钝头剪刀打开腹壁纵向，使沿左肋的尾部边缘横向两个额外的削减，揭露隔膜。切掉膜片切胸壁在两侧osteocartilageneous边框。解除胸壁含有胸骨暴露心脏中央板坯的尾端。 除去心包，使在左心室的前端的小的精确切割承认灌注装置的插管。使用一个钝套管具有0.6毫米的直径。通过脑室轻轻走过套管至顶尖将出现升主动脉，并用夹子固定套管。以允许血液和灌流液从血液流出口，使在右心房的切口。 灌流小鼠transcardially用蠕动泵的流速起初5毫升/分钟，用PBS（25mM的，0.9％氯化钠，pH值7.4）中约1分钟，随后冰冷的固定剂为7分钟。 固定后，切断小鼠头部有一对剪刀，然后切开皮肤通过中线从颈部到鼻子。取下的肌肉充分暴露颅骨。 用锋利的剪刀，让通过枕部和枕骨大孔开始interparietal骨头纵向切割。用细镊子取出这些骨头，露出整个小脑。然后，让通过顶叶和额叶留到鼻骨另一纵剪切和镊子删除它们，露出整个大脑。 用刮刀取出大脑而不损坏它，并将其放置在冰冷的0.1M PB。 切片和试样的修整 切成大约5冠状块 – 用含有感兴趣的区域剃刀叶片6毫米。它粘到持有人的vibroslicer用氰基丙烯酸酯胶。定向组织块，以使新皮质朝向振动的刀片。切片冠状切片，将含有杏仁核，在冰冷的0.1M的PB 140微米与vibroslicer（ 图1A），并收集它们在相同缓冲液中的6孔培养皿中。 在立体显微镜，修剪出的感兴趣区域（这里是ITC的内-背paracapsular集群，参见图1B）从切片。为此在涂有聚硅氧烷弹性体和填充用0.1M PB培养皿，用眼科手术刀。确保修剪块放入隔离（约1.5mm）（ 图1B）的孔。 移动修剪成块冷冻保护液（30％甘油在0.1M PB）O / N为6ºC。 3.高压凝注：FRIL由6基本步骤（ 图2）：1）快速冷冻用高压（2300 – 标本2600条）。 2）试样的压裂。裂缝平面大致如下冷冻的膜的中心疏水核心，将它们分成两个半膜小叶：即位于相邻的原生质（P-面）一半和位于相邻的胞外或exoplasmic空间半（E-面对）。 3）由铂和碳的真空沉积在试样的复制。 4）的组织的洗涤剂消化。 5）免疫标记。 6）使用透射电子显微镜的副本的分析。 铜载体的制备 注：要通过FRIL过程的连续阶段被处理，试样需要被安装到金属（金或铜）的载体。根据压裂和使用的机器类型的模式，规模和设计，这些运营商不同而不同。在这里，我们使用的铜载体（ 图1B，E）和一个铰接的“双副本表”; （参见图3B），它在打开时产生通过将冷冻样品的拉伸断裂（ 图2）。这允许保持和复制的断裂试样的两侧。 波兰航空公司铜用麂皮皮肤片晦暗卸妆。 地方的载体在玻璃锅和干净的非离子型洗涤剂（pH约1.5）中超声处理水浴两次，然后广泛自来水中，随后用去离子水冲洗，然后用乙醇冲洗两次。 超声处理在丙酮铜载体15分钟。 放置在滤纸上的载体干燥。 附着双面胶带的一个环的铜载体（ 图1C），这将作为保持以及用于修剪块（保持载波）。 试样的冷冻 注：处理液氮的照顾和适当佩戴护目镜。 打开免费的高压诚单元（ 图1F）与试样冷冻开始之前至少1.5小时。 按“空气预热器”按钮，启动加热，烤了50分钟。设定空气温度至80℃。 连接的氮罐向高压冷冻单元并按下“氮”按钮，以填补在里面杜瓦用液氮。在“氮LEVEL”指示灯点亮。开始按“冷却”按钮冷却。 按“DRIVE IN”按钮时“氮素水平”熄灭。检查液压系统移动活塞来回3次。 按下“自动”按钮，和“氮”按钮。当“READY”亮起，高压冷冻机组准备高压冻结。 放置一个修剪块，其中已被熔化成股份公司的双面胶带（ 图1B）使用铂导线环的孔姑娘吸管。 除去多余的使用滤纸或刷子的冷冻保护剂溶液。 注意：此过程也很重要，以去除气泡，可能形成围绕组织和可能导致的组织的形状和/或超微结构失真。 下一个立体显微镜，覆盖夹持载体与另一种载体，使该组织的块被夹在两个载波之间。 插入载体夹层到高压冷冻单元（ 图1D）的试样保持器。将试样保持器到高压冷冻单元（头朝下），并通过在试样保持器螺纹连接固定。 通过按“喷气自动”按钮开始冷冻循环。尽快工作，取出样品支架和淹没用液氮尖端插入一个绝缘盒。沉浸2对钳的尖端在液氮冷却它们。 小心取下日E从试样保持器载波三明治，并将其放置在一个预先冷却冷冻管。确保该载体只用液氮冷却的镊子处理。冷冻管应该被穿孔，以允许氮气从小瓶（ 图1G）流出。 直到所有想要的样品都被冻结重复步骤3.2.6到3.2.11。包含相同类型的样品的多个载波三明治可以存储在相同的小瓶中。 含存放在冷冻槽运营商直到复制（ 图1H）的冷冻管。 图1.组织制备和高压冷冻。（A）中Vibroslicer用于部分的组织。   （B）与交流侧含有杏仁核显示一侧的冠状导致老鼠大脑部分奥珀载体装有双面胶带的一个环。虚线框表示兴趣，包含ITC的内侧paracapsular集群的区域。在双面胶带的孔的直径是约1.5毫米。 （C）工具准备铜载体。从左上方以顺时针方式：双面胶带，镊子，冲床，铜载体和剪刀。载波三明治成用于高压冷冻的试样保持器的（D）的插入。载波夹层放入试样保持器的孔。 （E）的铜的载体不具有和具有双面胶带的环和“载波三明治”。   （F）与加压罐馈送液氮它的高压冷冻单元。 （ 七 ）离心管去购买的冷冻组织。注意在小瓶允许氮气流出小瓶（箭头）的上中间位置的孔。 <st荣>（H）冷冻槽用于储存冷冻组织。 请点击此处查看该图的放大版本。 4.冷冻断裂和复制 电子束枪的研制 插入电子束枪前先取出盾牌的“导流板”。将“设置计”，通过较低的阴极罩中心长丝进入弹簧夹头。 注意：用于设置计的较大直径端的碳枪而较小直径端为铂枪。 滑过计新长丝直到“压力薄片”可夹住长丝的两端，确保灯丝线圈不在于以一角度。 取出设置表和插入碳棒。通过加强合作解决这个问题蒸发器杆保持器的llet卡盘，确保杆的端部的高度是在从底部第二线圈的中间。对于铂枪中，铂杆的端部的高度应在从顶部起第二灯丝线圈的中间。 更换偏转板和插入枪进入冷冻断裂装置中。随着使用后沙冲击波清洁枪。 图2.插图FRIL技术的关键步骤。 为准备和副本的分析所需的不同步骤的轮廓。 （1）组织的高压冻结。 （2）压裂。在冷冻组织的压裂，质膜的脂质双层是在疏水界面分成两半。在质膜蛋白被分配到要么exoplasmic（E-面）或原血浆膜（P-面）。 （3）复制。碳（C）的蒸发捕集的裂隙的组织的表面上的脂质和蛋白质。该材料涂覆有2nm的铂/碳在60°角阴影，然后用它加强复制品的结构（C-层，铂阴影）另一个为15nm的碳层。 （4）增溶。未捕获由副本膜组织，然后用SDS-溶液溶解。 （5）标记。目的蛋白质可以在复制品使用由特定的初级抗体（初级抗体）中，用一金颗粒（Au）的共轭次级抗体（二次抗体）的复合物可视化。使用不同大小的金颗粒的允许在相同的副本多于一种蛋白质的检测。 （6）免疫标记后，副本被收集到铜网格，并在80透射电子显微镜分析- 100千伏请CLICķ此处查看该图的放大版本。 设置冷冻断裂装置的向上 通过转动电网到1。的冷冻断裂和复制过程的详细描述切换冷冻断裂装置中（ 图3A）上，看到由制造商提供的使用说明书。 之前冷却该冷冻断裂装置中，烘烤用温空气的单元的整个冷却系统。按在MTC 010器件中的“解冻”按钮（温度控制单元）（ 图3A），并让45分钟的烘烤过程中运行。 激活真空站。冷冻断裂装置通常工作在约10 -6的真空范围- 10 -7毫巴。 填充氮气罐，并将其连接到冷冻断裂装置。检查阀支架干燥，也清洗罐的阀支架的插入之前的条目（湿度可以与VACUU干扰M和N个指示2填充油箱）。 开始由温度设定为-115℃的冷却。冷却时间约45分钟。 插入电子束枪与调整电流和电压，以达到蒸发以下参数： 碳枪：在旋转，位置90°，碳积累速率0.1 – 0.2纳米/秒碳铂枪：旋转关，位置60°，累积0.06的速率 – 0.1nm /秒注意：如果一个枪被用于第一次的碳或铂棒，脱气使用前3分钟的交换之后。 压裂和复制 将冷冻运营商的三明治到双副本表并确保所有的操作都​​在液氮中进行。 传送双副本表到杜瓦容器中，在45°的角度其固定在试样台接收机。液氮水平应该永远是双副本表的上方。 </LI> 拿起双副本表与表操纵器，并将其插入冷冻断裂装置上冷阶段。等待大约20分钟，以允许双副本表的温度调整到-115℃。 检查真空度低于10 -6毫巴，温度为-115℃。 断裂由连接到放置在双副本表上方的导流罩轮手动顺时针反向旋转的组织。当护罩转动，它迫使双副本表来打开，压裂的组织。 按在EVM 030设备（电子束蒸发控制单元）冷冻断裂装置（ 图3A）的“高张力”按钮。 由碳（旋转）通过定位在90°角的厚度为5nm的电子束枪的装置的蒸发复制裂隙的组织（ 图3C）的暴露表面，随后是单向shado翼带以60°角的厚度为2纳米的铂 – 碳。最后，从90°的角度（旋转）申请的碳的15纳米厚的层。 使用蒸发以下参数： 第一个碳：上旋转，位置90°;速度0.1 – 0.2纳米/秒; 5纳米第二碳铂：位置60°;速度0.06 – 0.1纳米/秒; 2纳米第三碳：上旋转，位置90°;速度0.3 – 0.5纳米/秒; 15纳米从冷冻断裂装置中取出样品复制，并将它们传送到陶瓷12孔板（ 图4A）充满TBS（Tris缓冲液，pH值7.4）。 使用白金环线材，取出试样载体（ 图4A）复制的组织。 直到所有样品都被复制，重复步骤4.3.1到4.3.10。 <b r /> 图3.冻结压裂和复制。 （ 一 ）冷冻断裂装置。机包含多个控制单元和监视器。试样引入室中，通过一个端口在腔室的左侧。一种加压液氮容器被连接​​到冷冻断裂装置以冷却阶段。图片下面的两个单位的显示放大图（UPC 010和MDC 010）和第二碳层的蒸发期间显示参数显示器。   （B）开（左）和双副本表的关闭（右）的景色。的“载波三明治”被插入到表中的所述槽（由箭头表示）。小武器防止“运营商的三明治”，从操作过程中脱落。 （C）断裂和复制样本。副本出现在裂隙组织顶部薄黑片。53 / 53853fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 副本的SDS-消化 传输副本，以填充用1ml的SDS-消化缓冲液（2.5％月桂基硫酸钠，在15毫摩尔Tris 20％蔗糖，pH值8.3）的4毫升的玻璃小瓶中。消化在80℃振荡（45冲程/分钟）18小时。 传输副本，以一个新的管填充用SDS-消化缓冲液并储存于RT。 5.免疫标记注：所有的孵育均在室温轻轻摇动进行，除了与抗体孵育。 洗净的副本在新的SDS-消化缓冲液10分钟。 用2.5％BSA（牛血清白蛋白）的TBS 5分钟，然后3×10分钟用0.1％BSA的TBS洗复制品一次。 在TBS块非特异性结合位点，用5％BSA的1小时。 主要适用于抗体稀释于2％BSA-TBS。在15℃下72小时（ 图4C）执行在潮湿室中30微升下降（ 图4B）保温。 在这项研究中，从破裂的组织过程中两个副本。孵育一个副本与针对氨基酸717提出了豚鼠多克隆抗体 – 754鼠标的GluR1共同所有AMPA-R亚基（稀释：1：200），或小鼠单克隆抗体针对重组融合蛋白募集覆盖氨基酸660 – 在NMDA-R的NR1亚基的811（稀释：1：500），和针对绿色荧光蛋白提出的兔多克隆抗体（稀释度：1：300）。 孵育其他副本与相应于氨基酸384针对合成肽产生一个兔多克隆抗体 – 398大鼠μ阿片受体的（稀释：1：500）。 的TBS洗含0.05％BSA（3×5分钟）。 应用二次抗体。在这项研究中ū本身金（5毫微米为离子型谷氨酸受体，10为μ阿片受体和/或供的ChR2-YFP 15纳米）的TBS稀释用2％BSA共轭的抗体。稀释二级抗体1:30，在15°CO / N的30微升下降孵育。 在RT在0.05％BSA-TBS洗涤3×5分钟。 洗在超纯水中2×5分钟。 上涂覆的Formvar-100线平行条格（ 图4D）安装复制品。 6.副本分析图像副本，在80或100千伏的透射电子显微镜（TEM）。通过由CCD（电荷耦合器件）照相机获取数字图像。 离线，找到使用地标（ 图4E）两个副本的图像对应区域。分析使用Image J。确定突触后区和针对分析该受体免疫标记的颗粒的数目的数字图像。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-页面="“1”"> 图4.副本的免疫标记。 （A）工具操纵和洗的副本。一种陶瓷12孔板（右上）和2种玻璃移液器（左上）。圆尖（左下）玻璃吸管用于传输副本，并用铂棒（底部中心）的吸移管是用来展开副本。在洗涤液的复制品（右下）。 （B）的副本的免疫标记以在组织培养6孔板的孔中放置一小片封口膜的滴（30微升）中进行。注意，一个副本由含有缓冲液的抗体的滴覆盖。为了防止蒸发，一片湿润薄纸的嵌合围绕井的内边缘。 （ 三 ）对孵化器的免疫标记的一步。孵育都在15℃下进行。 （D）安装在副本的formvar覆层100-线双杠网格。 （ 五 ）从一对副本的低倍显微照片。虚线方框表示三种典型的地标在相应的副本，以确定一个位置。比例尺：10微米。所有的数据都显示为平均值±SEM 请点击此处查看该图的放大版本。