JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
发育生物学

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

Published: March 10, 2016
doi:
10.3791/53814
, , , ,
1Pyrosequencing Core,Cincinnati Children’s Hospital, 2Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine,Seattle Children’s Hospital, 4Division of Asthma Research,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olarak, başlamak için en uygun hücre tiplerini belirlemek için araştırılmaktadır.

Havayolu epitel hücreleri allerjik inflamasyon 12 gelişiminde kritik ve epitel Immun ile etkileşim yoluyla alerjik tepkiler ve havayolu yeniden önemli bir sürücüE ve stromal hücreler. solunum yolu epitel Kalkış ve astım gibi akciğer hastalıklarının kalıcılığı önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, alt solunum yolu epitel hücreleri, özellikle sağlıklı kontrol ve çocukların, bir klinik ortamında elde edilmesi zordur. Hava kirliliği ve alerjenlere karşı tepkileri okuyan özellikle birkaç çalışmalardan elde edilen veriler, burun mukozasından epitel hücreleri alt solunum yolu epitel hücreleri 13-20 için geçerli ve pratik vekil olduğu öncül desteklemektedir. Burun mukozası% 90'dan fazla kirpikli hava yolu epitel hücreleri oluşur ve diğer hücre / doku örnekleme tekniklerine göre daha az invazif ve olduğu gibi bu burun epitel hücreleri (UEM) örnekleme kolayca yaş dört ya da beş gibi küçük çocuklarda yapılabilir enfeksiyon 20-23 gibi olumsuz olayların en az risk ile ilişkili. Bu, uzun gereksiz ve sıklıkla ağrılı bronkoskopi procedu olmadan sağlıklı ve hastalıklı çocuklara hem de örnek bir hızlı ve basit bir yol sunuyorsedasyon gerektiren res. Daha önceki çalışmalar, astım şiddeti ile ilişkili bir hastalık alt tipleri burun mukozası gibi astım çocuklardan alınan bronş hücre numuneleri hem de ayırt edilebilir olduğunu bulduk, ve iki doku tipleri arasında gen ekspresyonu olmayan yerde gen 22 yaklaşık% 90 benzer olan 24. iPSCs için bir kaynak olarak, UEM diğer sık ​​kullanılan hücre türleri üzerinde avantajlar sağlar. Fibroblastlar genellikle iPSC üretimi için kullanılan, ancak bu hücreler kolayca cilt biyopsisi kültüre olabilir, ancak, bu süreç genellikle lokal anestezi, bir kesi ve dikişler gerektirir ve enfeksiyon bazı riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, biyopsi bu tip hastaların bilgilendirilmiş onayını aldıktan 25 zor olabilir. fibroblastlar için bir alternatif periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) 'dir. Bununla birlikte, çocuk hastalar arasında iPSC oluşturulması için yeterli derecede kan elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, alt-AP sınırlamalar vardırfibroblast ve kan hücresi kaynaklı iPSCs, belirli hücre tipleri 5,26 özellikle kendi farklılaşma kapasitesi komplikasyonların. Bu nedenle, nispi erişilebilirlik ve kendi koleksiyonu aşağıdaki yan etkileri düşük riski göz önüne alındığında, UEM pediatrik popülasyonların gelen iPSC nesil için ideal bir hücre kaynağını temsil etmektedir.

iPSCs yeni hastalık modelleri, insani kalkınmayı okuyan üretmek için bir platform olarak son zamanlarda ilgi çok aldı ve kişiselleştirilmiş tedaviler için hücrelerin potansiyel bir kaynağı olarak var. Bu teknolojinin tam potansiyelini fark edilebilir önce yeniden programlama sürecinin moleküler temellerinin açıklanması gerekir, ama şimdi bu protokol ve içinde belirtilen usuller havayolu maruz odaklanmış araştırmalar ışık tutacaktır için, yanı sıra bir platform sağlamak iPSCs içeren kişiselleştirilmiş tıp etkilerini araştırmak.

Birkaç laboratuarları işbirlikçi çalışma Generatio yol açmıştırburun mukozasının örnekleme değil, aynı zamanda UEM kültürlenmesi ve iPSCs 23 bu hücrelerin yeniden programlanması sadece için başarılı bir teknik n. Bu makale optimum örnekleme, kültürleme ve yeniden programlama koşulları için bir protokol bir özeti verilmektedir.

Protocol

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder. 1. Burun mukozasının Örnekleme NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın. katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin. Açık sitoloji sadece örnek almadan önc…

Representative Results

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen "kara delik") ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının b…

Discussion

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

Materials

15mL conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -  Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1mM
55mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4ng/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. . Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. ‘Epigenetic memory’ phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Tags

Nasal Epithelial CellsInduced Pluripotent Stem CellsIPSCsAerated DiseaseAsthmaEpigenetic VariationAir PollutionNasal SamplingReprogrammingBEGMCytology BrushLive/dead Cell Stain

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image