Sitokrom Kapsüllenen<em> C</em> Metal Nanopartiküller olmadan Silika Aerojel Nanoarchitectures Gaz faz biyoaktivitesinin İstinat ederken

Özel güvenlik gözlükleri, laboratuar ceket ve laboratuvar eldiven işlem sırasında her zaman giyilmelidir. koruyucu gözlük veya gözlük olmadan kritik nokta kurutma cihazı kesinlikle çalıştırmayın. tetrametoksisilan, metanol, etanol, aseton ve amonyak içeren Bütün çözeltiler, bir çeker ocak içinde işleme tabi tutulmalıdır. 1. Buffer ve CYT olun. C Çözümleri ilk önce, potasyum fosfat monobazik ve 2.72 gr ağırlığında ve 500 mL'lik volumetrik bir şişeye kullanılarak su içinde eritilmesi ile 0.04 M potasyum fosfat monobazik, 500 ml hazırlamak pH 7, 40 mM potasyum fosfat tampon yaklaşık 750 ml yapmak için. potasyum fosfat dibazik ve 3.48 g tartılması ve 500 mL'lik volumetrik bir şişeye kullanılarak su içinde eritilmesi ile 0.04 M potasyum fosfat dibazik, 500 ml hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile büyük behere çift bazlı tuz solüsyonu dökün ve bir karıştırma plakası üzerinde çözeltisi karıştırma başlatıldı. Yavaş yavaş monobazik tuz s bölümlerini eklemekpH 7.00 olana kadar bir pH elektrodu ve metre ile pH'ı izlerken dibazik tuz çözeltisine Ç ÖZÜM. monobazik bir tuz çözeltisi yaklaşık 250-300 mi kullanılacaktır. Cam sintilasyon flakon cyt. C ve yerin yaklaşık 0.023 gr tartılır. Bir mikropipet kullanarak hazırlanan potasyum fosfat tampon maddesi, 2.000 ul ekleyin ve sonra yavaşça katı madde kırmızı Cyt tüm kadar karıştırın çözüm girdap. C çözeltisi içine çözündürüldü ve parçacıklı madde olmaya devam etmektedir. Elde Cyt. C çözeltisine 20 ul alın ve bir 1 cm yol uzunluğu plastik küvete ilave edin. Hazırlanan tampon 3 ml ekleyin. Referans hücrede tampon kullanarak 300-700 nm UV-vis spektrum atın. CYT kullanın. Cı absorbans (A) 106.100 M-1 cm-1 409 nm, yok olma katsayısı 31 (ε) olarak, küvet yol uzunluğu (I) ve Beer-Lambert kuralına konsantrasyonunu tespit etmek için (c) çözeltisi (A = εlc). Geri orijinal hazırlanan çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak. 2 ml hazırlanmış cyt. C çözümü mM 0,9-0,7 arasında konsantrasyon genellikle. Bir sintilasyon şişenin içine 0.72 mM hazırlanan cyt. C çözümü 117 ul pipetleme 0,105 mM 800 ul orijinal hazırlanan cyt. C çözümü sulandırmak. Sonra hazırlanan tampon 800 ul (bu durumda 683 ul) dengesini ekleyin. karıştırmak için girdap. Kesin hacimleri, orijinal hazırlanan Cyt tam konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. Cyt hacmi c çözeltisi. Pipeti (800 ul * 0,105 mm) olarak hesaplanır C / (orijinal Cyt. MM C konsantrasyonu). Orijinal hazırlanmış ve sulandırılmış CYT saklayın. C çözümleri 2-8 ° C'de buzdolabında en fazla iki hafta boyunca Kullanıma hazır olana kadar. 2. Sentez Silika (SiO2) Sol tek kullanımlık 50 ml'lik polipropilen beher Etiket 'Beaker A '. Bir analitik denge tava behere koyun ve beher içine 1.88 gr Tetrametoksilan eklemek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Sıfır bakiye ve ardından 'Bardak A' içine metanol 2.88 g pipetle. Parafilm ile kapağı 'Bardak A'. tek kullanımlık 50 ml'lik polipropilen beher 'Bardak B' etiketleyin. bir analitik terazi tavaya bir manyetik karıştırma çubuğu ve yer ekleyin. 0.75 g su ve 3.00 g metanol eklemek için bir cam pipet kullanın. Parafilm ile kapağı 'Bardak B'. daha sonra karıştırılırken karışım içine kapak Parafilm ile 28,0-30,0% amonyum hidroksit çözeltisi 5 ul eklemek için bir şırınga kullanın davlumbaz içine bir karıştırma plakası üzerinde 'Bardak B' içeriğini karıştırmaya başlayın. En kısa sürede adım 2.5 tamamlanır tamamlanmaz, 'Bardak B' için 'Bardak A' içeriğini ekleyin. Parafilm kaplı ise 20 dakika boyunca karıştırın. 3. Jel Kalıpları hazırlayın Not: Oradasilis sol karışımı adım 2.6 karıştırma iken jel kalıp hazırlamak için zamanı. ve ilgili kapaklar (dipleri kapalı dilimlenmiş ile 16 mm x 57 mm, birim boyutu 6.5 ml) 8-9 polipropilen sintilasyon şişeleri kazanır. jel üzerinde oluşturmak ve plastik ambalaj kapağı içinde bozulmadan kalır emin üzerine kapağı yerleştirmek için düz bir yüzey oluşturmak için şişenin kapağı ucuna plastik wrap koyun. tezgah üstünde kap sonu şişeleri aşağı kadar satır ve yukarı bakacak şekilde dipleri açtı. 4. CYT hazırlayın. C -Silika Sol-jel sol karıştırılması (aşama 2.6) tamamlanmasından sonra, temiz bir kağıt, 50 ml polipropilen deney şişesine sol karışımı 3 ml ekleyin. Yavaş 0,105 mM seyreltildi Cyt. ~ 1 dakika boyunca 3 ml Sol karışımına C çözeltisi (aşama 1.9 yapılmış) 500 ul açılan bir cam Pasteur pipet kullanın. CYT eklenirken, karışımın hafifçe girdap emin olun. C, büyük oluşumunu önlemek içinkırmızı kümeleri. Teorik olarak 3500 ul, hemen sol mi Cyt. C konsantrasyonu, 15 uM 0.105 mM Cyt. C çözeltisi 500 ul seyreltilmesiyle, miktarlar katkı maddesi olduğunu varsayarsak. Pipetleyin her Hazırlanan kalıbın içine çıkan cyt. C silis sol 0.5 ml. Ayrıca, süper kritik kurutma işlemi esnasında kontrol örnekleri olarak kullanmak için bir veya iki kalıplar içine geri kalan 'düz silika solüsyonunun 0.5 mL pipet. Parafilm ile kalıpların yüzü yukarı deliklerin üstünü ve sol-jel üretmek için (~ 2-8 ° C) gece veya en az 12 saat buzdolabında koydu. buzdolabından kalıpları atın. Bir CYT içeren bir kalıbın üst Parafilm çıkarın c sol-jel.; Ayrıca alttan kapağı ve plastik kaplamayı çıkarmaya. kalıba bir yıkama şişesinden bazı etanol ilave edildikten sonra, dikkatlice kalıp dışarı ve temiz bir 20 ml'lik cam sintilasyon şişesi cont içine jel itmek için bir şırınga pistonu dairesel bir disk ucunu kullanınetanol, yaklaşık 5 ml Tahliye. Cyt tüm kadar bu jel çıkarma işlemini (4.5 ve 4.6 adımları) tekrarlayın. C jeli şişeye ilave edilir ve silika jellerinin tümü ayrı bir şişeye ilave edilir. Cyt. C jel birden fazla konsantrasyon yapılmış ise, ayrı flakon içinde bir araya jeller gibi saklamak için emin olun. Sonra 2-8 ° C arasında etanol, şapka ve mağaza ile en üstüne şişeleri doldurun. Gün boyunca her dört saatte bir, buzdolabından jeller kaldırmak jeller kapalı etanol süzün ve taze etanol ile değiştirin. Ek üç gün boyunca, boşaltılması ve taze aseton günde üç kez ekleyerek, aseton ıslak sol jeller daldırın. 5. süperkritik Kuru Sit. C -Silika Sol-jeller 8 ° C'ye bağlı bir sirkülatörün sıcaklığı ayarlanarak 10 ° C'ye kadar bir kritik nokta kurutma makinesinin (Şekil 1 e bakınız) soğutun. Cihaz r var bir kere10 ° C eached, aseton ile bir transfer tekne doldurma ve aparatın içine mühürlenerek aygıtı üzerinde bir sızıntı testi gerçekleştirin. aparatın dolum vanasını açın ve cihaz yarım-dolana kadar karbondioksit ekleyin. dolum vanasını kapatın ve o-ringler veya mühürler bozulan olabilir kapı ve vanalar tıslama için dikkatle dinleyin. Bir sızıntı bulunursa herhangi bir O-halkalarını veya contaları değiştirin. Kaçak testi tamamladıktan sonra, davlumbaz ve drenaj içine aseton ve karbondioksiti serbest bırakmak için tahliye vanasını açın. Sonra aparat transfer tekne kaldırın. Cihaz kaçak ücretsiz emin olduktan sonra, dikkatlice aktarma teknenin üç uzun bölüme, aseton çoğu ile birlikte, sintilasyon şişeleri ıslak jeller dökün (örnek sepet ya da gazlı bez kapakları gerekli değildir). Delicately itin ve tüm jeller tamamen i sular altında olduğundan emin olmak için forseps ile tekne içinde jeller taşımakn, aseton. aparatın içine tekne sızdırmazlık önce gerekirse daha fazla aseton ekleyin. Daha sonra, karbondioksit eklemek kısa sürede karbondioksit ile karıştırma aseton aparatı pencereden aparatın dibine batan oldukları gözlemlenmiştir olarak beş dakika aseton serbest bırakmak için boşaltma vanasını açmak için aparatın dolum vanasını açın. aparat, karbon dioksit ile doldurulur önce doldurma valfi boşaltma sırasında gerekli olduğu ölçüde, açık kalmalıdır aparat boşaltma açık bile doldurmaya devam etmesi için alt aseton Bu seeping, ortaya çıkar. Tahliye vanasını kapatın. biraz açık kırık dolgu valfini tutun. Beş dakika sonra, cihaz, tüm tahliye süre boyunca tam olarak kalacak şekilde yeterince açılabilir tekrar beş dakika için tahliye vanasını açın ve dolum valfı ayarlayın. , Tahliye vanasını kapatın doldurma vanası açık kırık tutmak, o zaman bu drenaj adımı bir kez daha tekrarlamak beşDaha sonra dakika. Bu ilk üç boşaltma adımlarının ardından, yaklaşık en az altı saat süresi üzerinde her 40 dakika jeller içindeki sıvı karbon dioksit tarafından aseton tam değiştirilmesini sağlayan bir seferde 5 dakika boyunca drenaj açın. Her zaman aparatta sıvı seviyesi asla boşaltma sırasında teknenin üst altına düşerse, böylece her drenaj sırasında yeterince açık olmasını dolum vanasını ayarlayın. Bir kez drenaj adımlar tamamlandıktan, dolgu vanasını kapatın ve seviye cihazı pencereden bakarak sadece teknede dişleri üzerinde görünür kalır, böylece sıvı karbon dioksiti boşaltın. Sağlamak için 40 ° C'ye kadar bir aparat sirkülatörün sıcaklığını ayarlama bu kritik sıcaklık ve basıncının üstünde sıvı karbon dioksit, yükselir (T C = 31 ° C; P P = 7.4 MPa) arasındadır. Yaklaşık 15 dakika sonra sıvı menisc cihaza uygun bir cihaz pencereden süper kritik akışkan, sıvı geçişi gözlemlemekTeknenin dişleri üzerinde bize kaybolur. dengeleme süresi, en az 15 dakika, daha sonra, süper kritik akışkanın serbest başlaması havalandırma vanası küçük bir miktar açık izin verin. yaklaşık 45 dakikalık bir süre boyunca, serbest akışkan bir sabit, ama çok düşük bir tıslama duyulabilir şekilde aşamalı olarak boşaltım valfı daha geniş ve daha geniş açmaya devam ve basınç göstergesi yavaşça sıfıra düşeceği görülmektedir. aparatın basınç sıfıra geçtikten sonra, cihaz kapıyı açmak tekne kaldırmak ve temiz bir cam sintilasyon şişeleri yeni kurutulmuş aerojel yerleştirmek için forseps kullanabilir. 6. karakterize Sit. C -Silika UV-görünür ve Dairesel Dikroizm (CD) ile Aerogels Spektroskopisi UV-Visible spektrofotometre veya CD spektrometresi ışın yolunda aerojel yekpare tutmak için bir karton platformu hazırlayın. Böyle labo bir kutudan karton (hafif karton 2.5 cm x 2.5 cm parça kesipratory doku), sonra tekrar kesme tarafından oluşturulan iki flep, kat, yarıya kadar kat kesmek, ikiye katlayın. ortada bir 1,5 cm x 1,5 cm kare delik ile, hafif karton 5 cm x 5 cm parça kesin. Sonra 0.5 cm x 0.5 cm beklemeye boyutunu azaltmak için siyah elektrik bandı kullanın. Küçük bükük yüzey bir aerojel monolit için oluşturulan böylece karton 5 cm x 5 cm parçasının karşı katlanmış ve kesim karton kanatlar 0,5 cm x 0,5 cm delik doğrudan önünde oturmak için bant (bakınız Şekil 2) . Delik ışın yolu ile uyumlu olacak şekilde daha sonra UV-görünür spektrofotometre ile karton geri parça bantlayın. bir mikrometre ile, yol uzunlukları kullanılacak jeller, kalınlığı ölçülür. karton platformunda bir jel yerleştirin ve UV-görünür spektrofotometre referans bölmesindeki hava ile 300-800 nm bir spektrumu ölçmek. Polinom, A = a Fit </em> λ n absorbans (A), arka saçılma kaynaklanmaktadır dalgaboyu (λ) bölgesinde, ~ 700-800 nm. Katsayısı arasında bir sayı, tipik olarak uygun olan yaklaşık 1 x 10 8 x 10 6 1 ve n katsayısı 2 ve 3 ~ arasında bir sayı, tipik olarak uygundur. Uyum elde edilen katsayılar, a ve n kullanarak, diğer dalga boylarında dağılım hesaplayın. Bir dağılım düzeltilmiş spektrum elde etmek için ham spektrumun bu hesaplanan dağılım arka plan absorbans çıkarın. aerojelin Soret tepe tepe yüksekliği, tepe merkezi ve tepe genişliğini belirlemek için uygun bir yazılım (gram / AI 8.0) kullanılarak 490 nm ila 370 aralığında bir Gauss eğrisi ile dağılım çıkarılır spektrumu takın. Yol uzunluğu (l) 106100 M sönüm katsayısı 31 (ε) için jel ölçülen kalınlığı kullanılarak Beer-Lambert Kanunu uygulamak -1 cm -1 </sup> ve Soret tepe yükseklik (A), aerojel (A = εlc) 'de Cyt. C konsantrasyonu (c) hesaplamak için. Hesaplanan CYT karşılaştırın. C konsantrasyonu konsantrasyonu teorik jel (15 uM) içinde aerojel dahilinde cyt. C canlılığı tespit etmek için. Tipik yüzde canlılıkları% 100'e yakın, ancak canlılıkları hesaplama CYT tükenme katsayısı biraz daha farklı olması tahmin edilmektedir solüsyon 31 cyt. C tükenme katsayısı dayanmaktadır çünkü sadece tahmin olduğu unutulmamalıdır. bilinmemektedir aerojel c. Lambayı açmadan önce en az 5 dakika CD enstrüman çalıştırın azot. Delik ışın yolu ile uyumlu olacak şekilde CD spektrometresi karton tutucu bantlayın. Üç taramaların bir ortalamasını alarak 100 nm / dk'da 350-500 nm karton tutucu hiçbir şey ile sürekli dalga boyu boş spektrumu ölçmek. karton platformunda bir jel (daha önce adım 6.2 ölçülen kalınlık) yerleştirin ve üç taramaların bir ortalamasını alarak, 100 nm / dk'da 350-500 nm bir spektrumu ölçmek. ilgi tüm aerojel yekpare için UV-görünür ve CD ölçümleri tekrarlayın. 7. CYT ile Nitrik Oksit varlığı (NO) Gaz Algılama. C -Silika Aerogels DİKKAT: NO çalışma tehlikelidir ve tüm YOK gaz davlumbaz içine davlumbaz ele veya bitkin alınmalıdır. NO sürekli maruz kalma YOK hava ile temas ettiğinde oluşturacak gibi son derece zehirli nitrojen dioksit ve / veya azot tetroksit dokulara toksiktir. HAYIR suyla temas ettiğinde ısı ve korozif gazlar da üretilmektedir. iyi havalandırılan bir davlumbaz içinde 8 L nitrik oksit silindiri (% 10 nitrik oksit,% 90 azot) yerleştirin ve 4 psi basınç ayarlayın. 6 ps ayarlanmış bir azot silindir (basınç hem nitrik oksit silindirine ve boru bağlayıni) ve T-valf boru uçlarını bağlamak () Şekil 3a bakın. Deney için bir aerojel tek parça seçin ve bir mikrometre ile kalınlığı (veya yol uzunluğunu) ölçün. plastik kapaklı bir tek kullanımlık küvet içinde aerojeli (~ 3 mm kalınlığında) yerleştirin ve spektrofotometre içine küvet koydu. küvete sığacak şekilde gerekirse hafifçe aerojeli kesin. Küvetin plastik kap, T valf çıkışına bağlı bir, (Şekil 3B), davlumbaz içine egzos olarak hizmet etmek üzere bir tübe bağlı bir İki şırınga iğneleri yerleştirin. boru ve küvete kapağa iğneler mühür Parafilm kullanın. Referans hücrede boş atılabilir küvete koyun. aerojel önce deney başlamadan ışın yolunda yatıyor olmasını sağlamak için aerojel küvet konumunu ayarlayın. 800 ile 300 nm arasında bir ilk spektrum al. 4 absorbans arasındaki farkı izleme14 nm ve 408 nm 'de absorbans hiçbir zaman azot ya da nitrik oksit / azot karışımı o kadar yüksek akış hızı olduğundan emin olduktan belirlenen zaman aralıklarında, nitrojen ve nitrik oksit / azot karışımı arasında geçiş yapmak için, T-valf döndürerek aerojel küvet içinde dolaşır. maruziyet çevrim tamamlandıktan kez, 800 ila 300 nm arasında bir son spektrumu al. ortalama bir algılama yanıt almak için üç ila dört monolitten işlemi tekrarlayın.