シトクロムをカプセル化<em> C</em>金属ナノ粒子なしのシリカエアロジェルナノアーキテクチャで気相生物活性を保持しながら、

安全メガネまたはゴーグル、実験室コート、実験用手袋は、手順の間に常に着用します。安全メガネまたはゴーグルなしで臨界点乾燥装置を操作しないでください。テトラメトキシシラン、メタノール、エタノール、アセトン、及びアンモニアを含有する全ての溶液をドラフト内で処理されるべきです。 1.バッファとCYTしてください。Cソリューション 、pH7の40 mMリン酸カリウム緩衝液〜750 mlとするために、第一リン酸二水素カリウム2.72gのを秤量500 mlの容量フラスコを用いて水に溶解して0.04 Mリン酸二水素カリウムを500mlを調製します。 リン酸カリウム二塩基性の3.48グラムを秤量し、500ミリリットルのメスフラスコを用いて水に溶解して0.04 Mリン酸カリウム二塩基性の500ミリリットルを準備します。 攪拌棒を備えた大型のビーカーに二塩基性塩溶液を注ぎ、撹拌プレート上の溶液を攪拌し始めます。 ゆっくりと一塩基性塩秒の部分を追加します。pHが7.00になるまでpH電極とメーターでpHをモニターしながら二塩基性塩溶液にolution。一塩基性塩溶液の約250-300 mlを使用します。 ガラスシンチレーションバイアル中でCYT。c及び場所の約0.023グラムを量り分けます。マイクロピペットを用いて調製されたリン酸カリウム緩衝液2000μlを添加し、その後緩やかに固体、赤のcytのすべてになるまで混合するためのソリューションを渦巻く。cが溶液中に溶解しており、無粒子状物質が残っています。 用意したcyt。C溶液 20μlを取り、1cmの経路長のプラスチックキュベットに追加します。準備されたバッファーの3ミリリットルを追加します。 参照セル内のバッファを使用して、300〜700 nmのからのUV-VISスペクトルを取ります。 CYTを使用してください。C吸光度濃度（c）を決定するために、409 nmの（A）、106100 M -1 cm -1 で 、キュベットの経路長（L）、およびランベルト・ベールの法則の吸光係数31（ε）溶液（A =εLC）の。 元調製した溶液の濃度を計算します。 2ミリリットルを調製CYT。C溶液は、mMの0.9から0.7の間の濃度であるのが典型的です。 シンチレーションバイアルに0.72 mMの準備のcyt。C溶液の117μLをピペットで0.105 mMの800μlの元の準備のcyt。C溶液を希釈します。その後、準備されたバッファー800μlの（この場合は683μl）をのバランスを追加します。混合する渦巻。正確なボリュームは、元の準備のcytの正確な濃度に依存して変化する。チトクロームのボリュームとしてC溶液を。ピペットを（800μlの* 0.105 mM）のように計算されるC /（オリジナルCYT。mMの中のC濃度）。 オリジナルの準備および希釈CYTを格納します。Cソリューションを2-8℃の冷蔵庫で2週間まで使用する準備ができるまで。 2.合成シリカ（SiO 2）ソル使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカーにラベルを付ける」してアーカーA '。化学天秤の皿の上にビーカーを置き、ビーカーに1.88グラムのテトラメトキシシランを追加するためにガラスパスツールピペットを使用しています。ゼロバランスと「ビーカーA 'にメタノール2.88グラムをピペット。 パラフィルムでカバー「ビーカーA '。 使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカー「ビーカーB 'をラベルを付けます。化学天秤の皿の上に磁気攪拌棒と場所を追加します。 0.75グラムの水および3.00グラムのメタノールを追加するためにガラスピペットを使用してください。 パラフィルムでカバー「ビーカーB '。 その後、攪拌しながら混合物にカバーし、パラフィルムを介して28.0から30.0パーセントの水酸化アンモニウム溶液5μlを挿入するために注射器を使用し、ヒュームフード内部の撹拌プレート上で「ビーカーB 'の内容物を攪拌し始めます。 すぐにステップ2.5が完了すると、「ビーカーB 'に'ビーカーA」の内容を追加します。パラフィルムでカバーしながら20分間、混合液を撹拌しました。 3.ジェル金型を準備します注：ありシリカゾルの混合物は、ステップ2.6で撹拌しながら、ゲル型を準備する時間です。 8-9ポリプロピレンシンチレーションバイアル（オフスライスした底部とのx 57ミリメートル16ミリメートル、ボリュームサイズ6.5ミリリットル、）とそれに対応するキャップを獲得。ゲルは上の形成と、それはプラスチック製のラップはキャップの内側そのままとどまることを確認することの上にキャップを配置するための平坦な表面を作成するために、バイアルのキャップ端部の上にラップを入れてください。 作業台の上にキャップエンドとバイアルを上下線と上を向いて底を開きました。 4. CYTを準備します。C -シリカゾル-ゲル （ステップ2.6）を混合ゾルが完了すると、きれいな使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカーにゾル混合物の3ミリリットルを追加します。 ゆっくりと0.105 mMの希釈CYT。〜1分かけて3ミリリットルゾル混合物にC溶液（ステップ1.9で行われた）の500μLをドロップするようにガラスパスツールピペットを使用してください。 CYTを加えながら静かに混合物を旋回するようにしてください。cが大の形成を回避するために、赤い塊。 0.105ミリモルのチトクローム500μlの希釈することにより、ボリュームが添加されていると仮定。3500μLにC溶液を、ゾル中になりましたcyt。C濃度は、理論的には、15μMです。 ピペットで各準備金型内に生じたCYT。Cシリカゾルの0.5ミリリットル。また、超臨界乾燥工程中に、対照試料として使用するために、1つまたは2つの金型に残った「プレーン」シリカゾルを0.5mlをピペット。 （〜2〜8℃）で一晩またはゾル – ゲルを生成するために、少なくとも12時間、パラフィルムで金型のフェイスアップ開口部を覆い、冷蔵庫に入れて。 冷蔵庫から出し金型を取ります。 CYTを含む1の金型の上からパラフィルムを外しCゾルゲル。また、底部からキャップ、プラスチックのラップを取り外します。 金型内に洗浄瓶からいくつかのエタノールを添加した後、慎重に金型のうち、きれいな20mlガラスシンチレーションバイアルの続きにゲルをプッシュするシリンジプランジャの円形ディスクの端を使用エタノールの約5ミリリットルをaining。 CYTの全てまで、このゲルを除去手順（4.5および4.6ステップ）を繰り返す。Cゲルをバイアルに添加し、シリカゲルの全てを別のバイアルに添加します。 CYT。Cゲルの複数の濃度がなされた場合は、別々のバイアル内で一緒にゲルのように保管してください。その後、2〜8℃の間のエタノール、キャップや店舗でトップにバイアルを埋めます。 一日を通して4時間ごとに、冷蔵庫からゲルを削除ゲルからエタノールをデカントし、新鮮なエタノールと交換します。 追加の3日間、一日三回をデカントし、新鮮なアセトンを追加し、アセトンで湿ったゾルゲルを水没。 5.超臨界乾燥CYT。C -シリカゾル-ゲル 8℃に取り付けられたサーキュレータの温度を設定することにより、10°Cに臨界点乾燥装置（ 図1参照 ） を冷却します。 装置は、rを持っていたら、10°Cをeached、アセトンで転送ボートを充填し、装置の内部でそれを密封することにより装置上のリークテストを実行します。 装置の充填弁を開き、装置が半満杯になるまで二酸化炭素を追加します。 充填弁を閉じ、Oリングやシールが悪化することができるドアやバルブでヒスノイズのために注意深く耳を傾けます。 漏れが見つかった場合に任意のOリングやシールを交換してください。 リークテストを完了した後、ドラフトのドレインにアセトン及び二酸化炭素を放出する排出弁を開きます。その後、装置から転送ボートを削除します。 装置は、漏れがないことを確認した後、慎重に転送ボートの三長いセクション（検体バスケットやガーゼカバーは必要ありません）に、大部分のアセトンと一緒に、シンチレーションバイアルからの湿ったゲルを注ぎます。微妙にプッシュし、すべてのゲルが完全に私が水没していることを確認するためにピンセットでボート内でゲルを動かしますn個のアセトン。装置の内部にボートを密封する前に、必要に応じてより多くのアセトンを追加します。 その後、二酸化炭素を追加するとすぐに二酸化炭素と混合し、アセトンを装置の窓から装置の底に沈むことが観察されるように5分間アセトンを解放するために、排水弁を開くために、装置の充填弁を開きます。装置が完全に二酸化炭素が充填されているので、ドレインが開いている間に装置があっても記入していきますように、充填弁が排水中に必要な範囲で開いたままにする必要があります前に、下にアセトンをこの染み出しが発生します。 排水バルブを閉じます。充填弁が少し開いて割れておいてください。 5分後、再び5分間排水バルブを開き、装置が完全なままであるように全体の排水時に十分に開放する充填弁を調整します。この排水ステップ1より多くの時間5を繰り返した後、充填弁が開いて割れておく、排水バルブを閉じます分後。 これらの最初の3排水ステップに続いて、ゲル内の液体二酸化炭素によってアセトンの完全な交換を確実にするために、少なくとも6時間のスパンで約時ごとに40分を5分間ドレンを開きます。常に装置内の液面が排水中にボートの上を下回ったことがないように、各排水中に十分に開放する充填弁を調整します。 いったん排水の手順が完了し、レベルは装置の窓を通して見ることによってだけでボートに乗って突起の上に表示されたままとなるよう充填弁を閉じ、液体二酸化炭素を排出します。 確実にするために40°Cに取り付けられた装置サーキュレータの温度を設定することをその臨界温度及び圧力より液体二酸化炭素が上昇（TはC = 31°C、PのC = 7.4 MPaで）。 約15分後、液体meniscの装置の窓を通して超臨界流体への液体の移行を観察しますボートのプロング上記の私たちが消えます。平衡時間の少なくとも15分、その後、超臨界流体を放出するために開始する通気弁を少量開く許可します。 約45分かけて、インクリメンタル広いベント弁を開放し続け、より広くなるように流体を放出するの着実な、しかし非常に低いヒスを聞くことができ、圧力ゲージがゆっくりとゼロに減少することが観察されます。 装置の圧力がゼロになった後は、装置の扉を開くボートを削除し、清潔なガラスシンチレーションバイアル中で、新たに乾燥エアロゲルを配置するために鉗子を使用しています。 6.特徴付けCYT。C -シリカUV可視および円偏光二色性（CD）とのエアロゲル分光紫外可視分光光度計またはCD分光計のビーム経路にエアロゲルモノリスを保持するために段ボールプラットフォームを準備します。 そのようなラボの箱から段ボールとして（軽量段ボール2.5cmの×2.5センチメートル片を切り取りratory組織）、当時、切断することによって作成された2つのフラップを、倍、倍に途中でカットアップ、半分に折ります。 ミドルさ1.5cm×1.5平方cmの穴で、軽量段ボールの5センチメートル×5センチの部分を切り取ります。その後、0.5センチメートル×0.5 cmのホールドのサイズを小さくするために黒い絶縁テープを使用します。 小さ ​​な曲がった表面はエアロゲルモノリスのために作成されるように、段ボールの5センチメートル×5センチピースに対して折り畳まれ、カット段ボールのフラップが0.5センチメートル×0.5センチメートルの穴の正面に座るためのテープ（ 図2を参照します） 。穴がビーム経路に沿ったものであるので、次に、紫外可視分光光度計に段ボールの背面部分をテープで固定します。 マイクロメータを用いて、経路長のために使用されるゲルの厚さを測定します。 段ボールのプラットフォーム上で1つのゲルを配置し、紫外可視分光光度計の参照コンパートメント内の空気と300から800ナノメートルからスペクトルを測定します。 多項式を取り付け、A = A </em>のλnは 、吸光度（A）は、バックグラウンド散乱が主な原因である波長（λ）領域、〜700〜800 nmまで。係数は〜1×10の間、通常、数に適合している8と1×10 6とn係数は、一般的に〜2と3の間の数に適合しています。 係数を用いて、他の波長での散乱を計算し、A及びnは 、フィットから得られます。 散布補正スペクトルを得るために、生のスペクトルから、この計算された散乱バックグラウンドの吸光度を減算します。 散布は、ピーク高さ、ピーク中心、及びエアロゲルのソーレーピークのピーク幅を決定するために、適切なソフトウェア（GRAMS / AI 8.0）を用いて、370〜490ナノメートルの領域にガウス曲線でスペクトルを差し引いフィット。 、経路長（L）は106100 Mの吸光係数31（ε）をゲルの測定厚さを使用して、ランベルト・ベール法則を適用-1 cm -1 で </SUP>とソーレーピーク高さ（A）は、エアロゲル（A =εLC）中のcyt。Cの濃度（c）を計算します。 計算されたCYTを比較してください。C濃度を濃度に理論的にはゲル（15μM）にエアロゲル内のcyt。Cの生存能力を確認します。典型的なパーセント生存率は100％に近いが、これらの生存率は計算がCYTの吸光係数よりもわずかに異なると推定されるソリューション31中のcyt。Cの吸光係数に基づいているためだけでは推定していることに留意すべきです。知られていないエアロゲルにおけるc。 上のランプをオンにする前に少なくとも5分のCD楽器に窒素を実行します。 穴がビーム経路に沿ったものであるので、CD分析計に段ボールホルダーをテープで固定します。 3回のスキャンの平均を取って、100 nmの/ minで350〜500ナノメートルから段ボールホルダーに何もないとの連続波長のブランクスペクトルを測定します。 段ボールのプラットフォーム上で1つのゲル（以前にステップ6.2で測定された厚さ）を配置し、3回のスキャンの平均を取って、100 nmの/ minで350〜500ナノメートルからスペクトルを測定します。 関心のあるすべてのエアロゲルモノリスのための紫外可視およびCD測定を繰り返します。 7. CYTで一酸化窒素の存在（NO）ガスを検出します。C -シリカエアロゲル注意：NOでの作業は危険であり、すべてのNOガスは、ヒュームフードにドラフト内で取り扱うないか、排出されるべきです。 NOへの持続的な曝露は、NOが空気に接触したときに形成されるように非常に有毒な二酸化窒素および/または四酸化二窒素の組織に対して毒性です。 NOは、水と接触すると、熱及び腐食性のフュームも生成されます。 よく換気ドラフト内で8 L一酸化窒素シリンダー（10％一酸化窒素、90％の窒素）を配置し、4 psiのに圧力を調整します。 一酸化窒素シリンダーの両方に6 PSに設定さ窒素ボンベ（圧力にチューブを接続しますi）およびT-バルブにチューブの端部をリンクアップ（ 図3a参照 ）。 実験用のエアロゲルモノリスを選択し、マイクロメーターで厚さ（またはパスの長さ）を測定。 プラスチック製のキャップを使い捨てキュベットにエアロゲル（〜3mm厚）を配置し、分光光度計にキュベットを置きます。キュベットに収まるように、必要に応じて少しエアロゲルをカットします。 キュベットのプラスチックキャップ、T-バルブの出力に接続された1つ、およびヒュームフードに排気として機能するチューブに接続された1つ（ 図3bを参照）に2注射針を挿入します。チューブとキュベットにキャップに針をシールするためにパラフィルムを使用してください。 基準セルに空の使い捨てキュベットを置きます。 エアロゲルは、実験前を開始するビーム経路にあることを確認するために、エアロゲルのキュベット位置を調整します。 800〜300nmの初期スペクトルを取ります。 4での吸光度の差を監視します14 nmおよび408 nmでの吸光度を確認し、その時間がないで、窒素または一酸化窒素/窒素混合物の流量は非常に高いことを行う設定時間間隔で窒素及び一酸化窒素/窒素混合物の間で切り替えるためにT-バルブを回しながらエアロゲルは、キュベット中で動き回ります。 露光サイクルが終了したら、800〜300nmの最終的なスペクトルを取ります。 平均センシング応答を得るために3〜4モノリスを使用して手順を繰り返します。