JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

incapsulante citocromo<em> c</em> In Silica Aerogel nanoarchitetture senza metallo nanoparticelle, pur mantenendo bioattività gas-phase

Published: March 01, 2016
doi:
10.3791/53802
, ,
1Department of Chemistry & Biochemistry,Fairfield University

Summary

Questa procedura descrive come incapsulare citocromo c (cit. C) in silicio (SiO 2) sol-gel, processo questi gel per formare bioaerogels, e utilizzare questi bioaerogels di riconoscere rapidamente l'ossido nitrico (NO) attraverso una reazione in fase gassosa. Questo tipo di protocollo può essere di aiuto nel futuro sviluppo di biosensori o altri dispositivi bioanalitici.

Abstract

Applicazioni come sensori, batterie e celle a combustibile sono state migliorate mediante l'uso di aerogel altamente porosi quando i composti funzionali sono incapsulati all'interno delle aerogel. Tuttavia, esistono alcuni rapporti sul incapsulare proteine ​​all'interno sol-gel che vengono elaborati in modo da formare aerogel. Una procedura per incapsulare citocromo c (cit. C) di silice (SiO 2) sol-gel che vengono supercritically elaborati per formare bioaerogels con attività in fase gas per l'ossido nitrico (NO) è presentato. Cyt. C viene aggiunto a un sol di silice mista in concentrazione proteica controllata e bufferizzare condizioni resistenza. La miscela viene quindi sol gelificato e il liquido di riempimento dei pori del gel viene sostituita con una serie di scambi solvente con anidride carbonica liquida. L'anidride carbonica è portato al suo punto critico e scaricata fuori per formare aerogel secco con cit. C incapsulato all'interno. Questi bioaerogels sono caratterizzati con UV-visibile spettroscopia und spettroscopia di dicroismo circolare e può essere utilizzato per rilevare la presenza di ossido di azoto in fase gas. Il successo di questa procedura dipende regolazione della concentrazione c cit. E la concentrazione di buffer e non richiede altri componenti come nanoparticelle metalliche. Può essere possibile incapsulare altre proteine ​​utilizzando un approccio simile rendendo questa procedura importante per il potenziale sviluppo futuro dispositivo bioanalitica.

Introduction

Citocromo c (cit. C) è una proteina chiave elettrone-trasferimento coinvolti nelle reazioni di respirazione cellulare del corpo. E 'stato dimostrato di essere coinvolti nell'apoptosi, una forma controllata di morte cellulare, e può rilevare piccole molecole tali tossici come ossido di azoto e monossido di carbonio 1-3. L'ossido nitrico (NO) gioca un ruolo in una varietà di processi fisiologici che avvengono nel sistema nervoso, cardiovascolare e immunitario. Mentre cit. C tipicamente richiede un ambiente acquoso tamponato a pH neutro per rimanere strutturalmente intatti e attivo, la ricerca ha dimostrato che la cit. C può mantenere la sua struttura e la funzione in materiali solidi conosciuti come aerogel in determinate condizioni 4-9.

Gli aerogel sono materiali altamente porosi spesso formate sintetizzando ossidi metallici sol-gel (Mentre aerogel di ossido di metallo sono molto comuni, carbonio e altri tipi di aerogel sono stati sintetizzati. Un esempio è InP aerogels) 10 ed essiccamento questi sol-gel in modo tale che la matrice solida porosa rimane invariato 11-14. Tutti i pori in aerogel solido risultato in disponibile Superficie fare molto aerogel estremamente utile per tutte le applicazioni in cui le reazioni di superficie sono importanti. Quando chimica o biochimica funzionalità è assemblato all'interno nanoarchitecture aerogel, è stato dimostrato che la porosità fisica e una maggiore area superficiale delle aerogel contribuiscono a migliorare sensori, nonché elettrodi per batterie, celle a combustibile, e applicazioni supercondensatori 11,15-23 . Per asciugare aerogel in modo tale da lasciare la matrice solida porosa invariato, è tipico per rimuovere il solvente che rimane nei pori dopo la sintesi sol-gel tramite estrazione con solvente supercritico. Qualsiasi crollo pori che possono essere causati dalle forze di tensione superficiale come solvente evapora dal gel sono ridotti al minimo, perché in essiccazione supercritica, un'interfaccia liquido-vapore mai forme.

<p class="jove_content"> Ci sono molte segnalazioni di emoproteine ​​quali cit. c viene incapsulato in sol-gel che sono state tenute bagnato o che sono stati essiccati ambiently 24-30. Rapporti di biomolecole incapsulamento a sol-gel che vengono poi essiccati supercritically per formare aerogel sono più rari a causa dell'elaborazione necessaria che può essere dannosa per la struttura di molte proteine. Nel caso di cit. C, determinate condizioni permettono di mantenere la capacità di cit. C per rilevare e rispondere a ossido nitrico fase gas all'interno aerogel. Una volta stabilizzato nel aerogel, la struttura dei pori di alta qualità del aerogel facilita la reazione tra cit. C e 4,8,9 ossido nitrico. Cit. C può essere incapsulato all'interno aerogel dal primo associandolo a più livelli intorno a nanoparticelle d'oro o d'argento in soluzione 4-8. Queste sovrastrutture multistrato servono a proteggere la proteina nella matrice aerogel. Nella più recente approach che abbiamo sviluppato, in cui la concentrazione di proteine ​​e buffer di forza sono controllati insieme ad altre condizioni di sintesi, cit. c mantiene l'integrità nei aerogel anche senza metallo nanoparticelle associazione iniziale 9.

La sintesi inizia come molte sintesi aerogel iniziano miscelando precursori di silice sol-gel per un determinato periodo di tempo. È dopo un tempo impostato che cit. C viene aggiunto come soluzione tampone nella miscela miscelazione. Gelificazione si verifica quindi a formare una struttura solida porosa di silice in cui i pori sono riempiti con acqua, metanolo, rimanenti reagenti e sottoprodotti. Questo liquido che riempie i pori può essere risciacquato con vari solventi attraverso una serie di scambi di solventi, gli ultimi scambi con anidride carbonica liquida che si svolge all'interno di un apparecchio per il punto critico di essiccamento mantenuti a bassa temperatura. Portando il gel di sopra della temperatura critica (31,1 ° C) di anidride carbonica facilita la formazione comefluido upercritical all'interno dell'apparecchiatura in pressione che può essere sfiatata forma secca, aerogel altamente porosi. La temperatura relativamente bassa necessaria per il biossido di carbonio per formare un fluido supercritico è vantaggioso rispetto ad altri solventi perché mantiene la proteina di sotto di una temperatura alla quale potrebbe denaturare.

Il nostro approccio senza metallo nanoparticelle di incapsulare cit. C in aerogel è vantaggiosa perché è una procedura semplice che può portare allo sviluppo di un protocollo più generalmente applicabile per incapsulare altre proteine ​​pure. Molte proteine ​​non possono interagire con nanoparticelle metalliche nello stesso modo in cui cit. C fa e sintesi metallo nanoparticelle o acquisto aggiunge tempo e spese aggiuntive alla procedura. I pochi rapporti sul incapsulare proteine ​​in aerogel rendono lo sviluppo di questa procedura un significativo passo in avanti per trovare una procedura più generale per incapsulare altre proteine ​​in aerogel che possono aiutare in potenziale futuri dispositivi bioanalitici.

La sezione di protocollo di questo manoscritto descrive come sintetizzare silice sol-gel, incapsulare cit. C in queste sol-gel, asciugare questi sol-gel composito per formare aerogel, caratterizzano questi bioaerogels utilizzando la spettroscopia UV-visibile e circolari dicroismo e rilevare la presenza di ossido nitrico in fase gas con questi bioaerogels. Cit. C è stato incapsulato con successo in aerogel quando disciolto prima in 4.4 a 70 mm soluzioni acquose di tampone fosfato. Tuttavia, la struttura delle proteine ​​ottimizzata in aerogel è stato trovato per causare quando incapsulare 40 mm di fosfato di soluzioni tampone cit. C producendo caricato cit aerogel. Concentrazioni di C nel range di 5-15 micron 9. Pertanto, il protocollo indicato di seguito è quello di sintetizzare aerogel utilizzando soluzioni 40 mM tampone fosfato di cit. C con conseguente cit caricato. Concentrazione C in aerogel di 15 micron. </ P>

Protocol

Occhiali di sicurezza o occhiali, camice da laboratorio e guanti di laboratorio devono essere indossati in ogni momento durante la procedura. Non utilizzare mai l'apparato punto di essiccamento critica senza occhiali di protezione. Tutte le soluzioni contenenti tetramethoxysilane, metanolo, etanolo, acetone, ammoniaca e devono essere trattati all'interno di una cappa aspirante. 1. Fare Buffer e Cyt. C Solutions Per rendere ~ 750 ml di pH 7, 40 mM tampone fosfato di potassio, prima preparare 500 ml di 0,04 M di potassio fosfato monobasico pesando 2,72 g di fosfato di potassio monobasico e dissoluzione in acqua utilizzando un pallone tarato da 500 ml. Preparare 500 ml di 0,04 M di potassio fosfato bibasico pesando 3,48 g di fosfato di potassio bibasico e dissoluzione in acqua utilizzando un pallone tarato da 500 ml. Versare la soluzione di sale bibasico in un grande bicchiere di ancoretta e cominciare a mescolare la soluzione su un piatto mescolare. Aggiungere lentamente porzioni del monobasico sale soluzione alla soluzione di sale bibasico durante il monitoraggio del pH con un elettrodo di pH e strumento finché il pH è 7,00. saranno utilizzati circa 250-300 ml della soluzione di sale monobasico. Pesare circa 0,023 g di cit. C e il luogo in flacone di vetro scintillazione. Aggiungere 2,000 ml di tampone fosfato di potassio preparata utilizzando una micropipetta e quindi agitare delicatamente la soluzione a mescolare fino a quando tutto il solido, cit rosso. C è dissolta in soluzione e non particolato rimane. Prendere 20 microlitri della cit. Soluzione c preparata e aggiungere ad un 1 cm lunghezza del percorso cuvetta di plastica. Aggiungere 3 ml di tampone preparato. Prendere UV-vis spettro 300-700 nm utilizzando tampone nella cella di riferimento. Utilizzare l'cit. C assorbanza (A) a 409 nm, il coefficiente di estinzione 31 (ε) di 106.100 M -1 cm -1, la lunghezza del percorso cuvetta (l), e la legge di Beer-Lambert per determinare la concentrazione (c) della soluzione (A = εlc). Ritorno calcolare la concentrazione della soluzione preparata originale. Le 2 ml preparati cit. Soluzione c è tipicamente tra 0,7-0,9 mM di concentrazione. Diluire il preparato cit. Soluzione originale C a 800 ml di 0,105 mM pipettando 117 ml di 0,72 mM preparata cit. Soluzione C in una fiala di scintillazione. Quindi aggiungere l'equilibrio dei 800 ml (683 microlitri in questo caso) di tampone preparato. Agitare per mescolare. I volumi esatti varieranno a seconda della concentrazione esatta del citocromo preparata originale. Soluzione c come il volume di cit. C per pipetta viene calcolato come (800 microlitri * 0,105 mM) / (cit originale. Concentrazione c in mM). Conservare originale citocromo preparata e diluita. Le soluzioni C a 2-8 ° C in frigorifero fino al momento dell'uso per un massimo di due settimane. 2. Sintetizzare Silice (SiO 2) Sol Etichettare un usa e getta da 50 ml in polipropilene bicchiere 'BeAker A '. Posizionare bicchiere sul piatto di una bilancia analitica e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per aggiungere 1,88 g tetramethoxysilane nel bicchiere. Zero l'equilibrio e poi pipettare 2,88 g di metanolo in 'coppa A'. Copertina 'coppa A' con parafilm. Etichettare un usa e getta da 50 ml in polipropilene bicchiere 'Beaker B'. Aggiungere un ancoretta magnetica e posto sul piatto di una bilancia analitica. Utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere 0,75 g di acqua e 3.00 g di metanolo. Copertina 'coppa B' con parafilm. Iniziare a mescolare il contenuto di 'Beaker B' su un piatto mescolare all'interno di una cappa aspirante, quindi utilizzare una siringa per inserire 5 ml di soluzione di idrossido di ammonio 28,0-30,0% attraverso il Parafilm coprire nella miscela sotto agitazione. Appena passo 2.5 è completa, aggiungere il contenuto di 'Beaker A' a 'Beaker B'. Lavorare l'impasto per 20 minuti mentre coperto di Parafilm. 3. Preparare Gel Stampi Nota: Ciè il tempo di preparare gli stampi gel mentre la miscela sol di silice si muove al passo 2.6. Acquisire 8-9 polipropilene fiale di scintillazione (16 mm x 57 mm, il volume di 6,5 ml, con fondo a fette off) e tappi corrispondenti. Mettere l'involucro di plastica sopra l'estremità tappo del flacone per creare una superficie piana per il gel per formare sulla e posizionare il tappo su di esso facendo in modo che l'involucro di plastica rimane intatto all'interno del tappo. Allineare le fiale con tappo-end verso il basso sul banco e ha aperto fondo rivolto verso l'alto. 4. Preparare Cyt. C -silica Sol-Gel Al termine del sol miscelazione (passo 2.6), aggiungere 3 ml della miscela sol ad un monouso bicchiere da 50 ml polipropilene pulita. Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a scendere lentamente 500 ml di i 0,105 mM diluita cit. Soluzione c (fatta allo step 1.9) alla miscela sol 3 ml nel corso di ~ 1 min. Assicurarsi di ruotare delicatamente la miscela, mentre l'aggiunta del cit. C per evitare la formazione di grandiciuffi rossi. Supponendo i volumi sono additivi, diluendo 500 microlitri della soluzione c 0,105 mM cit. A 3.500 ml, la concentrazione cit. C ora nel sol è, in teoria, 15 pM. Pipettare 0,5 ml della risultante cit. Sol di silice c in ogni stampo preparato. Inoltre pipettare 0,5 ml del rimanente sol 'plain' silice in uno o due stampi da usare come campioni di controllo durante il processo di essiccazione supercritica. Coprire le aperture a faccia in su degli stampi con parafilm e mettere in frigorifero (~ 2-8 ° C) per una notte o per almeno 12 ore per la produzione di sol-gel. Prendere gli stampi dal frigorifero. Rimuovere il Parafilm dalla parte superiore di uno stampo contenente una cit c sol-gel.; anche rimuovere il tappo e involucro di plastica dal fondo. Dopo l'aggiunta di qualche etanolo da un flacone di lavaggio nello stampo, utilizzare l'estremità disco circolare di uno stantuffo della siringa per spingere accuratamente il gel dallo stampo e in un ambiente pulito 20 ml di vetro scintillazione flaconcino containing circa 5 ml di etanolo. Ripetere questa procedura di rimozione gel (fasi 4.5 e 4.6) finché tutte le cit. C gel sono aggiunti alla fiala e tutti i gel di silice vengono aggiunti ad una fiala separata. Se è stato fatto più di una concentrazione di gel c cit., Assicurarsi di memorizzare come gel insieme all'interno flaconcini separati. Quindi riempire le fiale verso l'alto con etanolo, tappo e conservare tra i 2-8 ° C. Ogni quattro ore durante il giorno, rimuovere il gel dal frigorifero, decantare il etanolo fuori i gel e sostituire con etanolo fresco. Durante altri tre giorni, immergere i gel sol bagnato in acetone, decantazione e aggiungendo acetone fresco tre volte al giorno. 5. Supercritically secco Cyt. C -silica Sol-Gel Raffreddare un apparecchio per il punto di essiccamento critica (vedi Figura 1) a 10 ° C impostando la temperatura di un circolatore collegato a 8 ° C. Una volta che l'apparecchio ha reached 10 ° C, un test di tenuta sull'apparecchio riempiendo una barca di trasferimento con acetone e sigillatura all'interno dell'apparecchiatura. Aprire la valvola di riempimento dell'apparecchiatura e aggiungere biossido di carbonio fino a quando il dispositivo è mezzo pieno. Chiudere la valvola di riempimento e ascoltare attentamente per sibilando alle porte e le valvole in cui O-ring o le guarnizioni possono essere deteriorando. Sostituire eventuali O-ring o guarnizioni se viene trovata una perdita. Dopo aver completato la prova di tenuta, aprire la valvola di scarico per scaricare l'acetone e il biossido di carbonio nello scarico di una cappa aspirante. Quindi rimuovere la barca transfer dall'apparecchio. Dopo aver verificato che l'apparecchio è esenti da perdite, con attenzione versare il gel bagnato dalla fiale di scintillazione, insieme con la maggior parte delle acetone, in tre lunghi tratti della barca trasferimento (cesti di campioni o le coperture di garza non sono necessarie). Delicatamente spingere e spostare i gel all'interno dell'imbarcazione con una pinza per garantire che tutti i gel sono completamente sommerse in acetone. Aggiungere più acetone se necessario prima di sigillare la barca interna dell'apparecchio. Aprire la valvola di riempimento dell'apparecchiatura per aggiungere anidride carbonica, quindi aprire la valvola di scarico per scaricare acetone per cinque minuti, non appena si osserva l'acetone miscelazione con l'anidride carbonica affondare al fondo dell'apparecchio attraverso la finestra apparecchiatura. Questo infiltrazioni dell'acetone al fondo si verificherà prima che l'apparecchiatura è completamente riempito con anidride carbonica, in modo che la valvola di riempimento deve rimanere aperta nella misura necessaria durante lo scarico in modo che l'apparecchio continuerà a riempire anche mentre lo scarico è aperta. Chiudere la valvola di scarico. Mantenere la valvola di riempimento incrinato leggermente aperta. Cinque minuti dopo, aprire la valvola di scarico per cinque minuti ancora e regolare la valvola di riempimento per aprire sufficiente in modo che l'apparecchio rimanga pieno durante tutto il tempo di drenaggio. Chiudere la valvola di scarico, mantenere la valvola di riempimento incrinato aperto, quindi ripetere questo passaggio drenante ancora una volta cinqueminuti dopo. A seguito di questi primi tre passi di drenaggio, aprire lo scarico per 5 minuti alla volta circa ogni 40 min nell'arco di almeno sei ore per garantire la completa sostituzione di acetone da anidride carbonica liquida all'interno dei gel. Regolare sempre la valvola di riempimento per essere aperta sufficiente durante ogni scarico in modo che il livello del liquido nel dispositivo non scende mai al di sotto della parte superiore della barca durante lo scarico. Una volta che passi drenanti sono, chiudere la valvola di riempimento, e scaricare l'anidride carbonica liquida in modo che il livello rimane visibile appena sopra i poli sulla barca, cercando attraverso la finestra dell'apparato. Impostare la temperatura dell'apparecchiatura circolatore collegato a 40 ° C per assicurare che il liquido aumenti di anidride carbonica sopra la sua temperatura e pressione critica (T c = 31 ° C; P c = 7,4 MPa). Dopo circa 15 minuti, osservare la transizione da liquido fluido supercritico attraverso la finestra apparecchiatura come menisc liquidonoi sopra i poli della barca scompare. Lasciare almeno 15 minuti di tempo di equilibrio, quindi aprire la valvola di sfiato una piccola quantità di cominciare a rilasciare il fluido supercritico. Nel corso di circa 45 minuti, continuare ad aprire gradualmente la valvola di sfiato sempre più ampia in modo che un sibilo, ma molto basso di fluido rilascio può essere ascoltato e il manometro si osserva a diminuire lentamente a zero. Dopo la pressione del dispositivo va a zero, aprire la porta dell'apparecchio, rimuovere la barca, e utilizzare pinze per posizionare gli aerogel appena essiccate in pulite fiale di vetro scintillazione. 6. Caratterizzare Cyt. C -silica aerogel con UV-visibile e dicroismo circolare (CD) Spettroscopia Preparare una piattaforma di cartone per contenere i monoliti di aerogel nel percorso ottico dello spettrometro spettrofotometro o CD UV-Visibile. Tagliare un pezzo 2,5 centimetri x 2,5 cm cartone leggero (ad esempio cartone da una scatola di labotessuto ratorio), piegarlo a metà, tagliare a metà strada sulla piega, poi piegare i due lembi, creato da taglio, di nuovo. Tagliare una x 5 cm pezzo 5 cm di cartone leggero, con un 1,5 cm x 1,5 cm foro quadrato al centro. Quindi utilizzare nastro isolante nero per ridurre le dimensioni della stiva di 0,5 cm x 0,5 cm. Tape i lembi del cartone piegato e taglio contro il 5 cm x 5 cm pezzo di cartone in modo che venga creata una piccola superficie piegata un monolite aerogel per sedersi direttamente di fronte al foro di 0,5 cm x 0,5 cm (vedi figura 2) . Poi nastro il pezzo posteriore di cartone allo spettrofotometro UV-visibile in modo che il foro è in linea con il percorso del fascio. Misurare lo spessore dei gel, che saranno utilizzati per lunghezze di percorso, con un micrometro. Posizionare un gel sulla piattaforma di cartone e misurare un spettro di 300-800 nm di aria nel vano di riferimento dello spettrofotometro UV-visibile. Montare un polinomio, A = a </em> λ n, alla regione di lunghezza d'onda (λ), dove l'assorbanza (A) è dovuto principalmente al fondo dispersione, ~ 700-800 nm. Il coefficiente è tipicamente in forma di un numero compreso tra 1 ~ 10 x 8 e 1 x 10 6 e il coefficiente n è tipicamente in forma di un numero compreso tra 2 e 3 ~. Calcolare la dispersione ad altre lunghezze d'onda, utilizzando i coefficienti, un e n, ottenuto dalla forma. Sottrarre questo assorbanza scatter sfondo calcolata dallo spettro grezzo per ottenere uno spettro di dispersione corretto. Montare spettro dispersione sottratto con una curva gaussiana nella regione da 370 a 490 nm utilizzando un software appropriato (GRAMS / AI 8.0) per determinare l'altezza di picco, il centro di picco, e la larghezza di picco del picco Soret del aerogel. Applicare la legge di Lambert-Beer utilizzando lo spessore misurato del gel per la lunghezza del percorso (l), il coefficiente di estinzione 31 (ε) di 106.100 M -1 cm -1 </sup> e l'altezza del picco Soret (A) per calcolare la concentrazione (c) della cit. c nella aerogel (A = εlc). Confrontare il citocromo calcolato. Concentrazione C alla concentrazione teoricamente nel gel (15 micron) per accertare la fattibilità del cit. C all'interno del aerogel. Viabilità per cento tipici sono vicino al 100%, ma va notato che questi Viabilità sono solo stime, perché il calcolo è basato sul coefficiente di estinzione del cit. C in soluzione 31 che si presume essere leggermente diverso rispetto al coefficiente di estinzione del cit. c nelle aerogel non note. Eseguire l'azoto nello strumento CD, almeno 5 minuti prima di accendere la lampada. Nastro il supporto di cartone allo spettrometro CD in modo che il foro è in linea con il percorso del fascio. Misura una lunghezza d'onda dello spettro vuoto continuo con niente nel supporto di cartone 350-500 nm a 100 nm / min, stabilendo una media di tre scansioni. Posizionare un gel (spessore precedentemente misurato nel passo 6.2) sulla piattaforma cartone e misurare un spettro di 350-500 nm a 100 nm / min, stabilendo una media di tre scansioni. Ripetere le misure UV-visibile e CD per tutti i monoliti di aerogel di interesse. 7. rilevare la presenza di ossido nitrico (NO) a gas con Cyt. C -silica Aerogels ATTENZIONE: Lavorare con NO è pericoloso e tutto gas NO dovrebbe essere gestita in una cappa aspirante o esaurito in una cappa aspirante. un'esposizione prolungata a NO è tossico per i tessuti come altamente velenoso biossido di azoto e / o tetrossido di azoto si forma quando nessuno viene a contatto con l'aria. Calore e corrosivi fumi vengono anche prodotte quando NO viene a contatto con l'acqua. Inserire un 8 L cilindri ossido nitrico (ossido nitrico al 10%, 90% di azoto) in una cappa ben ventilata e regolare la pressione a 4 bar. Collegare il tubo sia al cilindro di ossido nitrico e ad una bombola di azoto (pressione regolata a 6 psi) e collegare le estremità del tubo ad un T-valvola (vedere Figura 3a). Scegliere un monolite aerogel per l'esperimento e misurare lo spessore (o lunghezza del percorso) con un micrometro. Posizionare il aerogel (~ 3 mm di spessore) in una provetta con tappo in plastica usa e getta e mettere la cuvetta nella spettrofotometro. Tagliare il aerogel un po ', se necessario, per adattarsi nella cuvetta. Inserire due aghi siringa nel tappo di plastica della cuvetta, uno collegato all'uscita del T-valvola e uno collegato ad un tubo per servire come gas di scarico nel cappa (vedi figura 3b). Utilizzare Parafilm per sigillare gli aghi per il tubo e il tappo alla provetta. Inserire un cuvetta monouso vuoto nella cella di riferimento. Regolare la posizione cuvetta aerogel per verificare che aerogel risiede nel percorso ottico prima di iniziare l'esperimento. Prendere uno spettro iniziale da 800 300 nm. Monitorare la differenza tra l'assorbanza a 414 nm e l'assorbanza a 408 nm, mentre ruotando la valvola a T per passare tra azoto e la miscela ossido nitrico / azoto a intervalli di tempo fissi assicurandosi che in nessun momento è la portata di azoto o miscela di ossido nitrico / azoto così elevato che l'aerogel si muove nella cuvetta. Prendere uno spettro finale da 800 a 300 nm, una volta che i cicli di esposizione sono finiti. Ripetere la procedura con tre o quattro monoliti di ottenere una risposta media di rilevamento.

Representative Results

I risultati procedura descritta in aerogel contenenti valida cit. C. Come specificato al termine dell'introduzione, cit. C può essere incapsulata da soluzioni acquose tampone che vanno da 4.4 a 70 mm fosfato. Esempi di cit. C -silica (cit. C -SiO 2) aerogel a base di soluzioni contenenti diverse concentrazioni tampone sono mostrati in Figura 4. Tutti i gel sono relativamente traslucidi, con i gel a base di 70 mM di tampone più opaco. Un confronto della spettroscopia di cit. C in condizioni diverse è mostrato in Figura 5. Un tipico spettro (figura 5c) mostra la grande picco Soret circa 408 nm per cit. C -SiO 2 aerogel ed è molto simile allo spettro di cyt . c in soluzione (figura 5a). Inoltre, uno spettro di cyt.c incapsulato all'interno di aerogel con nanoparticelle metalliche è anche mostrato (figura 5b) e il cit. c -SiO spettro 2 aerogel è simile a questo spettro pure. Quando il citocromo. C -SiO 2 aerogel è esposto ossido nitrico, uno spostamento tipico del picco Soret si osserva (figura 5d). Gli spettri UV-vis per i gel a base di cit. Soluzioni c in concentrazioni variabili tampone sono mostrati in Figura 6. Tutti questi gel mostrano caratteristiche spettroscopiche UV-visibile presenta indicando che cit. C non è in uno stato denaturato entro i gel. Tuttavia, la diminuzione traslucenza dei gel costituito da 70 mM tampone risultati in un rapporto segnale-rumore per questi spettri. Gli spettri CD cit. C -SiO 2 aerogel sono simili a spettri di cit. C </em> incapsulati all'interno di aerogel con nanoparticelle metalliche, mentre entrambi i tipi di spettri aerogel differiscono da uno spettro di cit. c in soluzione tamponata (Figura 7). La figura 8 mostra una reazione di sorveglianza ossido nitrico tipico cit. C -SiO 2 aerogel e aerogel corrispondenti che contengono anche nanoparticelle metalliche oltre al cit. C. La differenza tra l'assorbanza a 414 nm e che a 408 nm è visto ad aumentare e poi diminuire quando i gel sono esposti a ossido nitrico e poi azoto rispettivamente in successione. Se l'anidride carbonica supercritica non viene rilasciato ad un ritmo abbastanza lento, la vitalità del cit. C entro i aerogel formate saranno compromessi. Questo è rivelato confrontando risultante spettri UV-visibile dopo la formazione gel rilasciando l'anidride carbonica a diversatariffe (figura 9). Figura 1: apparecchio per il punto critico di essiccamento Apparecchiatura di essiccamento punto critico mostrata dalla (A) anteriore e (B) indietro con la porta barca e apparecchio di trasferimento mostrata accanto alla parte posteriore dell'apparato.. Figura 2: piattaforma di cartone La piattaforma di cartone assemblati per lo svolgimento di un aerogel nel percorso del fascio di uno strumento.. Figura 3: Ossido nitrico rilevamento set-up L'ossido di rilevamento set-up di azoto è mostrato tra cui (A) la cappa chiusa l'ossido di azoto del 10%., 90% bombola di azoto, tubi, e T-valvola e (B) la cuvetta con aghi inseriti. Figura 4:.. Cit campione C -SiO 2 aerogel aerogel incapsulare 15 pM cit c in 4.4 mM, 40 mM, e 70 mM di tampone fosfato di potassio sono mostrati in confronto ad un centesimo da sinistra a destra.. Questi aerogel sono circa alta 0,2-0,5 cm. Ristampato con il permesso 9. Figura 5:. Cyt c -SiO 2 aerogel spettroscopia spettri Visible di 15 pM citocromo c in (a) 50 mM tampone fosfato sol.ution; (B) Au (5 nm) ~ cit c -SiO 2 aerogel.; (C) cit c -SiO 2 aerogel (esposto all'aria).; (D) cit. C -SiO 2 aerogel (esposto a ossido nitrico per 3,5 min). Questi spettri rappresentative del tipo di gel sono compensati per chiarezza, e la linea tratteggiata indica la posizione del picco di Soret di cit. C in tampone. Mentre ogni spettro è di 15 pM cit. C, gli spessori di gel (o le altezze) sono solo 0,2-0,5 cm rispetto alla soluzione 1-cm cuvetta per ottenere una soluzione di assorbanza superiore. Ristampato con il permesso 9. Figura 6: aerogel spettroscopia come concentrazione del tampone incapsulato viene variata Averaged UV-visibile di assorbimento spettrale di aerogel diviso per gel lunghezza del percorso per i gel incapsulamento 15 _.6; M cit c a 70 mm (nero) (media del 4 spettri), 40 mm (rosso, tratteggiata) (media di 8 spettri) e 4,4 mm (verde, tratteggiata) (media del 9 spettri) tampone fosfato di potassio. . Ristampato con il permesso 9. Figura 7:… Aerogel dicroismo circolare spettroscopia di dicroismo circolare spettri di cit c in soluzione tampone fosfato di sodio (solido), due rappresentante spettri di citocromo c -SiO 2 aerogel (tratteggiata), e due spettri rappresentante di Au (5 nm) ~ cit. c SIO 2 aerogel (tratteggiata). Ristampato con il permesso 9. Figura 8: rilevamento L'ossido nitrico con cit c -SiO 2. </. sub> aerogel Monitoraggio dello spostamento (ΔA = A 414 nm – A 408 nm). nell'intensità Soret di cit c (rosso fisso) e Au ~ cit c (tratteggiata blu) incapsulati in SiO 2 compositi nanoarchitetture aerogel il flusso di gas. viene commutato tra azoto (dove Soret picco massimo è a ~ 408 nm) e l'ossido nitrico (dove Soret picco massimo è a ~ 414 nm). Ogni curva è una media di 3-4 prove, con due dei cit c -SiO 2 studi monitorati a ΔA = A 414 nm -. A 407 nm dal momento che il primo picco massimo Soret era a 407 nm per queste prove. Ristampato con il permesso 9. Figura 9:. Effetto del tempo di rilascio fluido supercritico Averaged UV-visibile di assorbimento spettrale divisa per la lunghezza del percorso di gel per cit c -SiO 2 aerogel ENCA.psulating 10 micron cit. C in 50 mM tampone fosfato in cui gli aerogel supercritically secchi sono state fatte da entrambi rilasciando biossido di carbonio supercritico oltre 45 min (solido, il nero (media del 9 spettri)) o 7 min (tratteggiata, rosso (media di 4 spettri)). Ristampato con il permesso 9.

Discussion

Come descritto, questa procedura ha costantemente prodotto cit praticabile. C incapsulato all'interno di aerogel. La concentrazione di cit. C entro i aerogel può variare da 5 a 15 mM e la concentrazione tampone della soluzione c iniziale cit. Incapsulato entro i aerogel possono essere variazione da 4,4 a 70 mm fosfato senza gravi effetti negativi sulla vitalità proteine. Tuttavia, il centro di picco e la larghezza di picco della cit caratteristico. C Soret picco nel aerogel sono più vicini a quello che sono per cit. C in soluzione quando cit. C è incapsulato in aerogel da soluzioni di 40 mm di buffer 9.

La sintesi del cit. C -SiO 2 aerogel è influenzata dall'età di alcuni dei reagenti di partenza. Metanolo, tetramethoxysilane, e la soluzione di idrossido di ammonio sono tutti igroscopici e devono essere sostituiti ogni uno-a-due mesi. L'aumento di acqua che si accumula inquesti reagenti nel tempo colpisce le caratteristiche strutturali di gel e il tempo di transizione sol-to-gel.

Quando si esegue l'essiccazione supercritico, barca trasferimento l'apparato critico di essiccamento punto di può contenere fino a diciotto 0,5 centimetri di spessore, 1 gel cm di diametro. Come indicato nella sezione del protocollo, un ripieno specifico e procedura di scarico devono essere seguite per trasferire l'anidride carbonica in sol-gel. È importante notare che, all'inizio del protocollo drenante, la miscela scarico di biossido di carbonio e acetone scorre a un alto tasso che il tubo di scarico si blocca rigido con l'umidità condensa al ghiaccio all'esterno. La miscela drenare contiene acqua poiché l'acetone non è anidro e questa acqua può occasionalmente congelare in una misura che il tubo di scarico zoccoli realtà. È necessario guardare per tali zoccoli ed ascoltare per un arresto del flusso. La valvola di scarico deve essere chiusa per pochi minuti in modo che il intasamento si scioglie se viene rilevato un intasamento. Inla peggiore delle ipotesi, se la valvola di scarico non è chiusa, uno zoccolo può causare tanta pressione per costruire che il tubo di scarico si apre con forza fuori l'apparato. Dopo i primi periodi di scarico, la maggior parte dell'acetone sarà stato risciacquato dell'apparato, e la presenza di pezzi di ghiaccio bagnato diminuisce drasticamente. Lo scarico progressivamente assomigliare ghiaccio secco come protocollo di scarico continua con alcuna prova residua presenza acetone (ad esempio profumo) diventando rilevabile alla fine del processo di drenaggio.

Dopo l'anidride carbonica nell'apparato è passata da liquido a fluido supercritico e il processo di sfiato è iniziato, è necessario rilasciare il fluido a bassa velocità per almeno 45 min come indicato nella procedura 9. Un più alto tasso di rilascio può ridurre la vitalità di cit. C (come mostrato in figura 9) nei aerogel e gli aerogel stessi può realmente spezzare come the il fluido si precipita per sfuggire ai gel. In generale, anche quando gli aerogel rimangono intatti dopo l'apertura della porta dell'apparecchio, è importante maneggiare con cura e delicatamente come sono fragili e possono rompersi facilmente.

I gel di silice di controllo che si riversano lungo il citocromo c. -SiO 2 gel vengono utilizzati dopo essiccamento supercritico per determinare se il trasferimento di anidride carbonica nei gel ha avuto successo. A volte il cit. C -SiO 2 gel possono apparire torbida ed è importante per determinare se questo è dovuto al trasferimento incompleto solvente o se può avere a che fare con la concentrazione del cit. C o buffer incapsulato all'interno dei gel. Se i gel di silice senza cit. C sembrano avere un omogeneo, aspetto traslucido in tutto, questo può essere preso come la prova che il trasferimento del solvente si è verificato completamente anche se il cit. C -SiO 2 gel hanno una certa nuvolosità a loro. Nuvolosità entro i gel di silicesenza cit. c dopo essiccamento indica che alcune acetone rimasta all'interno dei gel durante lo sfiato.

Come indicato nella sezione del protocollo, importanti misure di sicurezza devono essere prese quando si lavora con l'ossido nitrico (NO). Per rilevare NO usando i aerogel, è necessario sigillare la cuvetta molto bene e per esaurire il gas che scorre sopra le aerogel in una cappa aspirante. In alternativa, l'intero spettrofotometro può essere spostato in una cappa insieme al cilindro di gas NO come precauzione per limitare l'esposizione al gas NO. A contatto con NO aria immediatamente produrre altamente velenoso biossido di azoto, tetrossido di azoto o entrambi. NO anche in grado di reagire con l'acqua per la produzione di calore e corrosivi fumi. Pertanto, l'esposizione sostenuta NO può causare tossicità per i tessuti diretta.

Quando si utilizza l'cit. C -SiO 2 aerogel per rilevare la presenza di ossido di azoto, la banda Soret sarà inizialmente a ~ 408 nm e si sposteràa ~ 414 nm in presenza di ossido nitrico. Dopo il passaggio indietro per l'azoto, la banda Soret dovrebbe invertire torna ad essere centrata a ~ 408 nm. Può anche essere possibile utilizzare la cit. C -SiO 2 aerogel per rilevare la presenza di altri ligandi come il monossido di carbonio 27.

Diverse procedure pubblicate includono un passo aggiunto di combinare nanoparticelle di oro o argento con cit. C in soluzione prima della miscelazione con il sol e supercritically essiccazione per formare aerogel 4-8. Confrontando la spettroscopia UV-visibile cit. C incapsulato in aerogel con nanoparticelle metalliche a quella della cit. C incapsulato in aerogel senza nanoparticelle metalliche mostra che questi due tipi di tecniche di incapsulamento producono cit. C della redditività simile nei aerogel (Figura 5) . Tuttavia, il cit. C incapsulato con nanoparticelle metalliche è leggermente più stabile di cit. C incapsulared senza nanoparticelle metalliche all'interno dei aerogel 9. Gli spettri CD di entrambi i tipi di citocromo c. Aerogel sono simili, anche se entrambi differiscono dallo spettro cit. C in tampone indicando alcune dispiegarsi cit. C nei aerogel (Figura 7). Precedenti relazioni sulla cit. C incapsulati in aerogel suggeriscono che la spettroscopia di dicroismo circolare è più probabile valutando lo strato più esterno di proteine, dispiegato a contatto con il gel di silice, nell'ambito di qualsiasi metallo nanoparticelle nucleate cit multistrato. Strutture C o strutture liberamente organizzate che formano quando non nanoparticelle metalliche sono presenti in aerogel 4,9. La maggior parte del cit. C nell'ambito di qualsiasi tipo di struttura auto-organizzata all'interno delle aerogel rimane piegato come misurato dalla spettroscopia UV-visibile però. Il vantaggio del protocollo descritto qui nanoparticelle sans è tale acquisto costoso o tempo sintesi di metallonanoparticelle non è necessaria. Le proteine ​​non sono stati spesso incapsulati con successo all'interno aerogel, e pertanto questa operazione è importante in quanto può portare allo sviluppo di un metodo più generale per incapsulare altre proteine ​​in aerogel con potenziale significato per i futuri dispositivi bioanalitici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il supporto per questo lavoro e / o la pubblicazione è stato fornito dal Science Institute di College of Arts di Fairfield University e Scienze, Facoltà Research Grant di Fairfield University, un premio Scienza Cottrell Collegio dal Research Corporation for Science Advancement, College of Arts & Sciences di Fairfield University e Dipartimento di Chimica e Biochimica della Fairfield University. Si ringrazia Jean Marie Wallace per visione molto utili e consigli per quanto riguarda questa zona di ricerca. Inoltre, rivolgiamo un ringraziamento speciale a tutti passati, presenti e futuri ricercatori universitari della Harper-Leatherman Research Lab.

Materials

Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 mL, O.D. x height (with cap):  28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 mL
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 mL syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. . Cytochromes c. Biological Aspects. , (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. . Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. . Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. . US Patent. , (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R., Minteer, S. D. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. 679, 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. . Aerogels. , (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. . Aerogels Handbook. , (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M., Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. , 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A., Poole, R. K. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. 437, 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

Cytochrome CSilica AerogelBiosensorBioactivityGas-phase ReactionEncapsulationSol-gelPorous MatrixProtein EncapsulationAnalytical DeviceTetraethoxysilaneMethanolWaterAmmonium HydroxidePolypropylene Vials

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image