매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
체외에서 차 해마 신경 세포를 배양하는 것은 신경 발달의 여러 측면의 기계적인 심문을 용이하게한다. 해리 배아 해마 신경 세포는 종종 혈청이없는 조건 하에서 고밀도로 커버 글라스에 성공적으로 성장할 수 있지만, 저밀도 문화는 일반적으로 영양 요소의 공급이 필요 시간이 소요될 수 있습니다 제조는 아교 세포 영양 세포층, 그들을 공동 배양 힘드는. 또한, 신경교의 존재는 신경 특정 메커니즘에 결과 및 해석을 배제 연구를 혼동 할 수있다. 여기서, 단순화 된 방법은 무 혈청 조건에서 아교 세포의 지원없이 매우 낮은 밀도 (~ 2,000 뉴런 / cm 2), 장기 (> 3 개월) 주 해마 신경 세포 배양에 표시됩니다. 저밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 커버 슬립 상에 성장하고, 24 웰 플레이트에서 성장 고밀도 뉴런에 대칭된다. 대신 betwee 공간을 만들기 위해 파라핀 도트를 사용N 개의 뉴런 층은, 실험자는 단순히 저밀도 신경 세포의 성장에 도움이되는 미소 공간을 만들기 위해, 고밀도 뉴런 상주하는 웰의 플라스틱 하부를 식각 할 수있다. 공동 배양을 용이하게, 따라서 이러한 뉴런의 형태 학적 및 생리 학적 연구를 촉진 저밀도 뉴런의 상당한 손실없이> 3개월 유지할 수있다. 이 성공적으로 배양 조건을 설명하기 위해 데이터를 장기간 배양 후 저밀도 세포에서 넘치 시냅스 형성을 보여주기 위해 제공됩니다. 본 공 배양 시스템은, 폴리 D 라이신 기재 따라서 autaptic 연결 형성 제도 성장 희소 개별 뉴런의 생존을 촉진한다.
Introduction
시험관 조건에서 해마 신경 세포 성장하는 것은 관찰과 생체 내에서, 그렇지 않으면 가능하지 않습니다 이러한 뉴런의 실험 조작을 할 수 있습니다. 이 실험 방법은 널리 성장, 극성 신경 돌기 사양, 인신 매매와 단백질의 세포 내 현지화, 시냅스 형성과 기능 성숙 하나의 신경 메커니즘을 나타 내기 위해 사용된다. 늦은 배아 단계에서 수확 때 이러한 체외 배양 된 해마 신경 세포는 피라미드 형태 2의 (> 90 %) 글루타메이트 세포 비교적 순수한 있습니다. 신경 세포는 생체 외 조건에서 2-D 표면에서 성장 되었기 때문에,이 방법은 하나의 초점면 (3)을 통해 라이브 영상 염색 또는 면역 세포 화학 (ICC)와 같은 쉽게 관찰을 허용한다; 이러한 약물 치료 및 형질 3-6이나 조작. 고밀도로 성장하면 신경 세포 때문에 더 높은 공동의 생존의 높은 비율을 갖는 경향이성장 배지에서, 또한 돌기 때문에 접촉 의존적기구 (7)의 영양 지원 외에 분비 된 성장 인자의 ncentrations. 그러나, 저밀도 해마 뉴런 개별 뉴런은 그 전체에 이미징 또는 ICC 분석 물들 수 학적 연구를하는 것이 바람직하다. 저밀도 뉴런 인해 분비 지원의 부족 문화에서 유지하기 어려운 때문에 종종 이전의 신경 세포 배양 2 준비하는 아교 (일반적으로 대뇌 피질의 성상 세포) 피더 층에서 영양 지원이 필요합니다. 신경교 세포 공급기 층과 공동 – 배양 할 때, 저밀도 뉴런 커버 슬립 상에 성장되고, 저밀도의 뉴런 및 아교 세포가 서로를 향하도록 한 후 아교 층 위에 대칭. 아교 세포와 신경 세포 사이의 작은 밀폐 된 공간 따라서 '샌드위치'레이아웃 2,8,9을 생성 된 커버의 모서리에 파라핀 왁스 점을 배치하여 만들어집니다. 저밀도 뉴런 w 성장할아교 세포와 신경 세포와 아교 세포에 의해 분비 농축 인자 허용 미세 환경을 만드는 커버 슬립 사이의 좁은 공간을 ithin. 이 방식은 저밀도 합리적 이격 완전히 개발 뉴런 따라서 용이 ICC 라벨 또는 라이브 영상 검사를 산출한다.
따로 시간과 힘든되는 신경 세포 – glia 공동 문화의 명백한 단점은,이 신경 세포 특이 적 또는 세포 자율 메커니즘의 연구를 방지한다는 것입니다. 이 시스템은 훨씬 덜 복잡한보다하지만 생체 신경 조직, 실험 (10)를 혼동 할 수 분비하지 아직 완벽하게 정의 된 요소를 통해 신경 세포의 개발에 아교 세포에 미치는 영향. 따라서, 신경 세포의 특정 메커니즘 조사 혈청 신경교 지지층이 필요 제거 정의 배양 조건을 필요로 실험한다. 이전의 연구는 일을 사용하여 신경 세포의 낮은 농도 (~ 9,000 세포 / cm 2)의 배양에 성공REE 차원 하이드로 겔 매트릭스 (11). 비교적 순수한 신경 인구 폐해를 지원하지 않는 무 혈청 조건에서 고밀도로 배양 할 수 있기 때문에, 우리는 해마 신경 세포의 매우 낮은 밀도로 혈청 규정 배지에서 성장 될 수 있다는 가설에 고밀도 신경 세포로 공동 배양 통상적으로 채택 된 신경 세포 – glia 공동 문화 유사 방법. 실제로, "샌드위치"구성의 고밀도 해마 신경 세포 배양은 최근 전문 magnocellular 신경 내분비 (12)의 소수를 지원하기 위해 사용되었다.
따라서, 고밀도 신경 세포와 공동 배양 저밀도 신경 세포가 장기 생존을 가능하게하기에 충분한 영양 요소 지원을받을 수있다. 배양 초 저밀도 신경이 프로토콜은 이렇게 공식화하고 검증 하였다. 프로토콜 고밀도 준비함으로써, 하나의 단일 실험 내에서 구현 될 수있다 (~ 250,000 세포 / ㎖) DISsociated 해마 뉴런 제 다음 밀도 ~ 10,000 뉴런을 얻었다 희석액을 만들고 / ㎖ (~ 3000 뉴런 / 커버 슬립 또는 ~ 2000 뉴런 / cm 2) 대부분 저밀도 배양보고보다 훨씬 낮은, 2,3,9 , 11,13. 이 배양 조건은 느슨하게 '매우 낮은 밀도'문화로하고, '저밀도'간 가변적으로 사용된다. 고밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 24- 웰 플레이트 상에 플레이 팅된다; 저밀도 뉴런 폴리 D 라이신 코팅 된 12-mm 유리 커버 슬립 위에 접종하면서 다른 24 웰 플레이트 내부에 배치되어있다. 뉴런 내려와 된 커버에 부착 된 후 저밀도 신경을 부착 된 커버와 함께 2 시간 이상 고밀도 뉴런의 상부에 뒤집혀있다. 또한, 대신에 고밀도 뉴런 층 위에 커버 슬립을 상승 파라핀 왁스 도트를 사용하는 18 G 주사기 바늘은 두 개의 평행 한 줄무늬로 24 웰 플레이트의 바닥을 에칭 하였다. 그 결과 DISPL했었죠는, 인접 플라스틱 커버 글라스에 대한 높은 지원을 제공합니다. 이 공간은 지속적으로 농축 된 영양 인자와 미세 환경을 제공하면서 충분한 산소와 배지를 교환 할 수 150-200 μm의에서 측정된다. 이 상태에서, 저밀도 신경 세포는 광범위하게 성장하고, 문화 삼개월 이상 살아남을 수 있습니다. 이 신경 세포는 문화에 삼주 후 GFP 플라스미드로 형질 때, 수상 돌기는 무릎을 꿇고 서라도 돌기 쪽이 박혀있다. 원리의 증거로, 데이터는이 공동 문화 시스템은 신경 세포의 조사를 용이하게 할 수있다 autaptic 연결을 형성 폴리 – D – 라이신 '마이크로 섬'에 시드 해마 신경 세포의 매우 낮은 밀도 문화를 지원하는 것을 보여주기 위해 제시 GPS 자율, 네트워크에 독립적 인 메커니즘.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 무 혈청 조건에서 매우 낮은 밀도 해마 글루타메이트 신경 세포의 장기 문화에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 뉴런 ~ 2,000 / cm 2, 밀도 또는 기존 문헌에서보고 2,3,11,13,14 신경교 지원없이 대부분 '저밀도'배양 제제보다 적어도 두 배 더 낮다에서. 초 저밀도 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 소설과 두 개 더 가지 방법으로 중요하다. 저밀도 뉴런 가까운 물리적 근접도 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
