Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Crescita neuroni ippocampali in condizioni in vitro consente osservazione e manipolazione sperimentale di questi neuroni che altrimenti non sarebbero possibili in vivo. Questo approccio sperimentale è ampiamente usato per rivelare i meccanismi neuronali della crescita, della polarità, le specifiche dei neuriti, il traffico e localizzazione subcellulare delle proteine, formazione di sinapsi e la maturazione funzionale ^1. Questi in vitro in coltura neuroni dell'ippocampo, quando raccolto dalle fasi tardo embrionali, sono relativamente puro (> 90%), le cellule glutamatergiche della morfologia piramidale ^2. Poiché i neuroni sono stati coltivati ​​in una superficie 2-D in condizioni in vitro, questo metodo permette una facile osservazione, come ad esempio l'imaging dal vivo o immunocitochimica (ICC) colorazione attraverso un unico piano focale ^3; o manipolazioni, come ad esempio il trattamento farmacologico e trasfezioni ^3-6. Quando coltivate ad alta densità, i neuroni tendono ad avere alti tassi di sopravvivenza a causa di una maggiore cooperazionencentrations di fattori di crescita secreti in aggiunta al supporto alimentare da parte dei media di crescita, e anche a causa di neuriti meccanismi di contatto-dipendente ^7. Tuttavia, a bassa densità neuroni dell'ippocampo sono desiderabili per gli studi morfologici, in cui un singolo neurone può essere ripreso nella sua interezza o tinto per l'analisi ICC. I neuroni a bassa densità sono difficili da mantenere in cultura a causa della mancanza di sostegno paracrino e quindi spesso richiedono il supporto trofico da un gliale (tipicamente corticale astrociti) feeder layer, che deve essere preparato prima la cultura neurone ^2. Quando co-coltura con uno strato alimentatore cellule gliali, neuroni bassa densità sono coltivate su vetrini e quindi capovolto sopra dello strato glia in modo che i neuroni e glia bassa densità di fronte all'altra. Un piccolo spazio chiuso tra glia e neuroni viene creato inserendo punti paraffina sugli angoli dei vetrini, creando così un 'sandwich' di layout ^2,8,9. I neuroni a bassa densità cresceranno well'ambito lo spazio confinato tra glia e il vetrino, che crea un microambiente permissivo con fattori concentrati secreti dai neuroni e glia. Questo approccio produce a bassa densità, i neuroni completamente sviluppati che sono distanziati ragionevolmente a parte, quindi, facilitando l'etichettatura ICC o studi di imaging dal vivo.

Un inconveniente apparente di neuroni-glia co-coltura, oltre ad essere in termini di tempo e laborioso, è che impedisce lo studio di specifici neuroni, o cellule autonome, meccanismi. Anche se questo sistema è molto meno complessa di in vivo tessuto neurale, impatto glia sullo sviluppo neuronale attraverso secrete, fattori non ancora completamente definiti possono confondere gli esperimenti ^10. Pertanto, in esperimenti che richiedono l'indagine dei meccanismi specifici di neuroni, condizioni di coltura definite che rimuovono siero e strato di supporto gliali sono necessari. Un precedente studio è riuscito a coltura basse concentrazioni di neuroni (~ 9.000 cellule / cm ²⁾ utilizzando un esimoree matrice idrogel dimensionale ^11. Dal momento che una popolazione neuronale relativamente pura può essere coltivato ad alta densità in condizioni di libero siero senza supporto gliali, ipotizziamo che ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo può essere coltivata nel siero libera definito terreno di coltura da loro co-coltura con i neuroni ad alta densità, in un modo che è analogo al neurone-glia co-coltura convenzionale adottato. In effetti, ad alta densità di ippocampo culture di neuroni in una configurazione a 'sandwich' sono stati recentemente utilizzati per sostenere un piccolo numero di neuroni endocrini magnocellulari specializzati ^12.

Pertanto, la co-coltura con neuroni alta densità possono consentire neuroni bassa densità di ricevere trofico supporto fattori che è sufficiente a consentire la sopravvivenza a lungo termine. Questo protocollo di neuroni ultra-bassa densità di coltura è stata quindi formulata e convalidato. Il protocollo può essere implementato all'interno di un singolo esperimento, preparando ad alta densità (~ 250.000 cellule / ml) DISciato neuroni dell'ippocampo, e poi facendo una diluizione per produrre una densità di ~ 10.000 neuroni / mL (~ 3.000 neuroni / vetrino, o ~ 2.000 neuroni / cm ^2), che è molto più basso rispetto alla maggior parte riferito culture a bassa densità ^{2,3,9 , 11,13.} Questa condizione cultura è genericamente indicato come la cultura 'ultra-bassa densita' e utilizzato con 'bassa densità' inter-changeably. I neuroni ad alta densità sono placcati in poli-D-lisina rivestite piastre da 24 pozzetti; mentre i neuroni a bassa densità vengono seminate su vetrini da 12 mm rivestite poli-D-lisina che vengono inseriti all'interno di un altro 24-pozzetti. I vetrini con aderendo neuroni a bassa densità sono capovolte sulla parte superiore dei neuroni ad alta densità di 2 ore più tardi, dopo i neuroni sono discesi e attaccati alle lamelle. Inoltre, invece di utilizzare punti paraffina per elevare i coprioggetti sopra lo strato neurone alta densità, un ago di siringa 18 G è stato usato per incidere il fondo delle piastre da 24 pozzetti con due strisce parallele. La risultante displACED, adiacenti plastiche forniscono un supporto elevato per i coprioggetti di vetro. Questo spazio è costantemente misurato a 150-200 micron, che permette lo scambio di ossigeno e terreno di coltura sufficiente mentre fornisce un microambiente con fattori trofici concentrati. In questa condizione, i neuroni a bassa densità crescere molto, e possono sopravvivere oltre tre mesi in coltura. Quando questi neuroni sono trasfettate con GFP plasmide dopo tre settimane di cultura, i dendriti sono abbondantemente costellate di spine dendritiche. Come prova di principio, i dati vengono presentati per dimostrare che questo sistema di co-coltura supporta culture ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo seminate su poli-D-lisina 'micro-isole', in cui i neuroni si formano le connessioni autaptic che possono facilitare indagini di cellula , meccanismi indipendenti dalla rete -autonomous.