Manutenção de um<em> Drosophila melanogaster</em> Gaiola População
Summary
This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Abstract
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Introduction
A capacidade de combinar abordagens genéticas e bioquímicas fez Drosophila um organismo particularmente adequada para Bioquímica e Biologia Molecular estudos 1-3. Estes estudos muitas vezes exigem grandes quantidades de material biológico, não só a partir de moscas adultas, mas também de larvas 4, pupas 5 e embriões 6-8. Para obter grandes quantidades de material, os pesquisadores têm moscas cultivadas usando recipientes grandes conhecidos como voar "gaiolas população". Estas gaiolas consistem de um cilindro feito de plástico coberta por uma rede em ambos os lados para permitir a introdução do alimento no interior da gaiola, sem as moscas que escapam. Essas gaiolas podem ser caseiros 9-11 ou comprado de uma empresa (veja a tabela de materiais específicos / equipamento).
Uma das principais vantagens da utilização deste sistema para crescer um grande número de moscas é que o ciclo de mosca da fruta 12 pode ser controlada de uma maneira que todas as moscas desenvolver em um relatively sincronizado maneira. Essa sincronização é conseguida semeando novos embriões, alimentando larvas / moscas e sacrificar as moscas adultas em momentos precisos. Usando uma população de moscas sincronizados é particularmente útil para estudos de desenvolvimento 13.
O início de uma nova gaiola população de algumas moscas é um processo demorado que requer muitos ciclos de amplificação 9-11. Mesmo usando maiores recipientes como garrafas de cultura mosca ou minicages, todo o processo pode durar meses. Para evitar este passo demorado, muitos laboratórios de Drosophila manter regularmente essas gaiolas. É mais conveniente para iniciar uma nova gaiola a partir de uma colheita de embriões a partir de uma população gaiola já estabelecida. Em geral, a maioria dos laboratórios manter gaiolas população de tipo selvagem, tais como Oregon R ou S. Canton Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para manter gaiolas população de moscas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Começando com 1,5 g de um material pode obter um rendimento de embriões recolhidos entre 7 e 13 g por ciclo. Para obter uma tal quantidade de material que é crucial para manter as condições de cultura adequadas para todas as fases do ciclo de mosca.
Os parâmetros mais importantes são a temperatura e umidade, que deve ser de 24 ºC e 35%, respectivamente. Se estes dois parâmetros não pode ser mantido constante no ambiente normal do laboratório, uma possibilidade seria a de colocar a gaiola mosca em uma incubadora ou numa câmara ambiental. Outros protocolos recomendado 70% de humidade e também um ciclo de luz-escuro de 24 h constante para aumentar o rendimento dos ovos produzidos 9,10. No entanto mantendo a humidade cerca de 35% evita contaminação bacteriana, e uma vez que o objectivo deste protocolo é apenas a manutenção de uma população gaiola, as moscas são mantidas em ambiente de luz normal do laboratório.
Outro ponto importante é manter disturbances para o adulto voa tão baixo quanto possível. Pode ser aconselhável manter a gaiola em um local separado da sala de voar para evitar a contaminação cruzada de outras moscas.
A cultura de grandes populações de moscas mutantes transgénicos e não é recomendada, uma vez que é muito difícil manter a sua pureza e podem exibir um comportamento de acasalamento anormal pronunciada em grandes gaiolas populacionais 14.
Um problema possível, enquanto a cultura de Drosophila em grandes quantidades, é a presença de outros organismos como os ácaros e / ou do molde, que irá competir para a comida e, por conseguinte, reduzir o rendimento de ovos produzidos. Para evitar isso, é muito importante para manter todo o equipamento limpa, lavagem da gaiola, redes e voar caixas com água e sabão, e desprezando o material descartável (tampões de espuma) depois de cada ciclo. Para reduzir o molde crescer, propiónico e ácido fosfórico são adicionados na levedura quando molhado preparando a comida mosca na etapa1.2 e Tegosept ao preparar o melaço bandeja no passo 3.1. Às vezes é útil para materiais lugar, como a caixa de plástico ou peneiras em -20 C, quando o tempo é curto e os materiais não podem ser limpos imediatamente.
Um ciclo coleção inteira ocorre em 14 – 15 dias, começando quando os embriões são semeadas na caixa de mosca e termina com o último dia da coleta. Durante este período de tempo, recomenda-se para organizar uma agenda para lembrar todos os passos necessários para a manutenção de uma gaiola mosca população (Fig. 2), detalhados na seção de protocolo. A partir do dia em que os ovos são semeadas, até que as moscas adultas emergem, é necessário apenas para inspeccionar a caixa de plástico, e quando ocorre a formação da pupa, a colocá-los dentro da gaiola. Depois disso, as moscas têm de ser alimentadas a cada 2 – 3 dias até que os embriões são semeadas para um novo ciclo. Em todo o protocolo, o dia mais longo é durante a colheita e semeadura dos embriões para iniciar um novo ciclo. UMAs comentou no protocolo, a melhor produção de ovos é de 3 – 5 dias após a eclosão de adultos e, finalmente declina 2 dias mais tarde. Isso nos dá uma certa flexibilidade, a fim de escolher o dia em que a colheita dos ovos será realizada.
Se por qualquer motivo o rendimento dos embriões colhidos é menor do que o montante de partida desejado (1,5 g), pode-se sempre adicionar uma nova bandeja de melaço e recolher mais ovos no dia seguinte. Para colecções constantes, recomenda-se manter a 2 gaiolas em paralelo, e se são necessárias quantidades mais elevadas de embriões, é também é possível utilizar maiores gaiolas. No caso de se fazer colecções de tempo curtos, uma maneira de aumentar o rendimento é o de tirar vantagem do sinal de sincronismo de postura de ovos pela manhã.
Há muitas vantagens de recolher grandes quantidades de vários estádios de desenvolvimento. Por exemplo, embriões colhidos em gaiolas população têm sido usadas com muito sucesso em ensaios de imunoprecipitação 6-8, collectio massan dos tecidos larvais de larvas dissociada tem demonstrado ser uma boa fonte para 3C experiências 4 e preparações de ARN 15, e as cabeças de moscas adultas têm sido utilizados para experimentos chip 16. Além disso, os adultos são muitas vezes necessários para fazer extractos de voar por cultura de tecidos 17.
Uma das aplicações mais promissoras da gaiola é fornecer material para ensaios de elevada produtividade que permitem a análise e rastreio de genes, transcrições, proteínas e metabolitos, em resposta à exposição de agentes patogénicos, as moléculas biológicas, substâncias químicas e radiação ionizante. Nestes ensaios em grande escala são necessários um grande número de indivíduos, e a população de moscas gaiola descrito aqui pode ser muito útil para a obtenção de grandes quantidades de material durante as diferentes fases do ciclo de vida de Drosophila para a sua análise e rastreio 18.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Materials
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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