Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
métaux essentiels jouent un rôle vital dans les fonctions biologiques normales, y compris les voies de messagers secondaires, les voies du métabolisme et les fonctions des organites. 30% de toutes les protéines sont considérées comme métallo – 1 et 50% de toutes les enzymes 2. Métalloenzymes utilisent ces métaux traces en tant que cofacteurs pour catalyser des réactions chimiques, stabilisent la structure des protéines, ainsi que pour des rôles régulateurs tels que des messagers secondaires. Certains des éléments de traces les plus étudiés en ce qui concerne la neurodégénérescence sont le cuivre, le fer et le zinc 3. Ils sont considérés comme étant impliqués dans de nombreuses voies de la maladie où par dyshomeostasis peut avoir des effets néfastes. Par exemple , l'état du métal de la superoxyde dismutase (SOD) influe directement sur la durée de vie et le phénotype des modèles de souris transgéniques de type familial de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 4. Dans la maladie d'Alzheimer, metalloproteomics techniques ont été utilisées pour découvrir une diminution de l'état du métal de la transferrine dans la pLasma 5. Ces études mettent en évidence les importants métalloprotéines de rôle peuvent jouer dans la maladie.
L'étude de métalloprotéines directement à partir de tissus biologiques est un champ de développement. Bien que certaines métalloenzymes ont été caractérisés, la majorité reste encore non caractérisé ou inconnue 6. L' un des principaux défis dans métalloprotéines de mesure est la nécessité de maintenir l'état natif de la protéine 7. Classical bottom-up techniques protéomiques reposent sur la digestion des protéines en peptides. Ce processus perturbe l'interaction non covalente de métaux et de leurs protéines. Ainsi, aucune information sur l'état de métal d'une protéine est acquise.
Une façon de surmonter ce problème est d'utiliser la chromatographie d'exclusion stérique associé à plasma à couplage inductif – 8,9 spectrométrie de masse (SEC-ICP-MS). Cela génère des informations sur la taille approximative de la protéine ainsi que tous les métaux qui sont associated 10 avec elle. En outre, l'exclusion de taille est une technique chromatographique douce qui peut préserver l'état natif d'un complexe d'enzyme ou protéine-protéine. Un avantage d'utiliser le plasma à couplage inductif – spectrométrie de masse (ICP-MS) est la nature quantitative de la technologie. L' utilisation d' un ensemble de normes de métalloprotéines il est possible de fournir une quantification absolue de métalloprotéines à partir d' échantillons biologiques 9,11. Ce résultat est obtenu en générant une courbe d'étalonnage en injectant métallo connues sur une plage de concentrations de métaux.
Ce protocole montre un exemple de la façon dont cela peut être réalisé pour une variété de normes de métalloprotéines. Dans cet article, nous visons à créer des courbes standard pour les métaux qui sont largement étudiés dans les domaines biologiques, y compris le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), l'iode (I), et le cobalt (Co).
Assurer l'état natif de la protéine signifie une attention particulière aux tampons utilisés et le stockage de l'échantillon sont nécessaires. Toutes ces techniques de chromatographie ou des techniques de préparation d'échantillons peuvent être utilisés. Il est important que les tampons utilisés dans la préparation des échantillons et la Chromatographie sont dépourvus de chélateurs de métaux et tampons d'utilisation qui miment le pH et les concentrations salines physiologiques. Autres conditions pour éviter incluent le chauffage de l'échantillon ou l' ajout de dénaturants de protéines (par exemple, l' urée). Il est essentiel de réduire au minimum le nombre de cycles de gel-dégel. La capacité de la mémoire tampon choisie pour lier les métaux divalents est également importante et est une raison pour laquelle les tampons Tris ou d'ammonium, de nitrate sont choisis sur des tampons à base de phosphate.
La résolution et le pic à faible capacité de l'exclusion de taille Chromatographie par rapport à d'autres formes de chromatographie est une limitation majeure de cette technique. Cependant, la nature douce de taille exclusion chromaphy est important de maintenir l'état natif de la protéine et ainsi préserver les obligations-protéine de métal relativement faibles. L'exigence de maintenir l'état natif des protéines nécessite une attention particulière au traitement des échantillons , y compris la limitation du nombre de cycles de gel – dégel, ce qui évite des chélateurs de métaux (par exemple, EDTA) ou sels et détergents chaotropiques.
Cette faible résolution de cette technique influe sur la capacité de quantifier la quantité de métal associée à une protéine spécifique si elle est dans un échantillon complexe que les pics observés contiendra plus d'une protéine. Par conséquent, la quantité de métal déterminée au moyen de l'intégration du pic serait une indication de la quantité totale de métal associé à la totalité des protéines en éluant à ce point dans le temps et non pas seulement une protéine spécifique. Afin de pallier cette limitation de la protéine d'intérêt devrait être davantage purifié dans des conditions natives. Cela permettrait la quantification dele métal associé à cette protéine pour être signalé avec un degré plus élevé de certainity. Une autre limitation potentielle de cette technique serait la perte de protéines due à une liaison non réversible à la colonne. Afin de déterminer si cela se produit une expérience de récupération doit être effectuée de sorte que la quantité de protéine éluant de la colonne est analysée pour déterminer si cela correspond à la quantité injectée. La même chose peut être faite en mesurant la teneur en métal du matériau d'élution et la matière de départ en vrac par ICP-MS. La récupération de la colonne peut varier en fonction des conditions utilisées, mais il a été montré que le rétablissement complet des protéines provenant d' une colonne d'exclusion de taille est possible 9. Ainsi, il est important de vérifier si oui ou non il y a une perte dans les conditions d'exploitation utilisé.
Les modifications apportées au protocole peuvent être liés aux normes de métalloprotéines qui sont utilisés, ainsi que les éléments analysés. Le type de metalloprotein nous normeed différera en fonction des éléments qui sont d'intérêt. Pour les éléments tels que Cu, Fe et Zn protéines, SOD et la ferritine sont employés. Toute autre metalloprotein ayant stoichometries connus peuvent également être utilisés et des exemples ont été représentés ici.
Une complication majeure qui peut résulter de l'utilisation de cette technique est l'accumulation de cristaux de sel dans la torche de l'ICP-MS. Afin d'éviter l'accumulation de cristaux de sel, la torche est lavée avec de l'eau distillée après chaque tranche de 500 – 1 000 ml de tampon qui a été transmis à travers le système ou, lorsqu'il est déterminé par inspection visuelle que la torche doit être lavée. Un autre problème qui peut se poser est une baisse plus rapide de la propreté de l'échantillon et d'extraction des cônes. Celles-ci doivent être nettoyés régulièrement en suivant les protocoles du fabricant.
La préparation de l'échantillon initial est l'étape la plus critique dans le protocole. S'il y a des changements à la protéine – complexe métallique l'information généré ne sera pas valide. C'est l'une des principales limitations de la technique; En outre, l'utilisation de la basse résolution, une colonne d'exclusion stérique donne une vue détaillée limitée de la complexité réelle de métalloprotéines en biologie.
La technique décrite ici permet l'expansion de la connaissance de la metalloproteome d'un organisme. analyse en vrac ne donne qu'une indication grossière de modifications à la quantité de métal dans un échantillon. Outre les considérations générales qui doivent être pris en compte, cette technique fournit un outil qui peut être utilisé pour quantifier la quantité de métal associée à des protéines ainsi que l'identification des métalloprotéines qui diffèrent en comparant les traces obtenues. L'utilisation de cette technique peut être utilisée pour identifier les différences entre les états pathologiques. Les métalloprotéines identifiés peuvent ensuite être étudiés pour aider à déterminer le rôle qu'ils jouent dans les processus de la maladie. L'application de césure ICP-MS a une croissanceavenir afin de déterminer le rôle des médicaments qui ont un hétéroatome tel que le platine, l'iode ou le cuivre comme ICP-MS peut être utilisée pour identifier les protéines qui se lie au médicament.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à souligner le soutien de Operational Infrastructure d'appui au programme du gouvernement de Victoria, le schéma de liaison des projets Australian Research Council (avec Agilent Technologies), le Centre de recherche Australian Medical Research Council, la banque du cerveau victorienne, Santé nationale et coopérative pour la santé mentale et la neuroprotéomique établissement.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |