Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare nell'occhio murino che provoca la perdita di cellule gangliari retiniche come osservato nel glaucoma. microsfere magnetiche vengono iniettati nella camera anteriore e attratti l'angolo iridocorneale utilizzando un magnete per bloccare il deflusso dell'umore acqueo.
L'uso di modelli di roditori di glaucoma è stato essenziale per comprendere i meccanismi molecolari che sono alla base della fisiopatologia di questa malattia neurodegenerativa multifattoriale. Con l'avvento di numerose linee di topi transgenici, vi è un crescente interesse in modelli murini inducibili di ipertensione oculare. Qui, presentiamo un modello di occlusione di glaucoma basato sull'iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio utilizzando un microago modificato con uno smusso sfaccettata. Le microsfere magnetiche sono attratti l'angolo iridocorneale utilizzando un magnete palmare per bloccare il drenaggio dell'umore acqueo dalla camera anteriore. Questa perturbazione in acquose dinamica determina una elevazione costante della pressione intraoculare, che successivamente porta alla perdita di cellule gangliari retiniche, come osservato in pazienti affetti da glaucoma umani. Il modello di occlusione microperla presentato in questo manoscritto è semplice rispetto ad altri modelli inducibili di glaucoma e anche altamenteefficace e riproducibile. È importante sottolineare che le modifiche presentate qui riducono al minimo i problemi più comuni che spesso sorgono nei modelli di occlusione. In primo luogo, l'uso di un microago vetro molato impedisce il riflusso di microsfere e assicura che minimo danno si verifica alla cornea durante l'iniezione, riducendo così gli effetti di pregiudizio connessi. In secondo luogo, l'uso di microsfere magnetiche garantisce la possibilità di ottenere la maggior parte delle perline all'angolo iridocorneale, riducendo il numero di perline galleggianti nella camera anteriore evitando il contatto con altre strutture (ad es., Iride, cristallino). Infine, l'uso di un magnete palmare consente flessibilità durante la manipolazione del piccolo occhio mouse per dirigere efficacemente le microsfere magnetiche e assicurarsi che c'è poca reflusso delle microsfere dall'occhio quando il microago viene ritirata. In sintesi, il modello murino di occlusione microperla qui presentata è un potente strumento di indagine per studiare i cambiamenti neurodegenerativi che si verificano durante l'insorgenza e la progressione della Glaucoma.
Il glaucoma è una malattia progressiva e irreversibile accecante che interesserà le stime, 80 milioni di persone in tutto il mondo entro il 2020 1. In pazienti affetti da glaucoma, perdita della vista è causata dalla morte selettiva delle cellule gangliari della retina (RGCs), i neuroni di output che trasmettono informazioni visive dal retina al cervello. Il glaucoma è una malattia neurodegenerativa legata all'età con molti fattori di rischio di cui il più comune è l'elevata pressione intraoculare (IOP). Infatti, IOP è l'unico fattore di rischio modificabile nel glaucoma e trattamenti attuali si concentrano esclusivamente sulla gestione della pressione oculare. Tuttavia, molteplici fattori genetici, cellulari e ambientali influenzano l'insorgenza e la progressione della malattia. Pertanto, la comprensione dei vari meccanismi che alla fine contribuiscono alla morte neuronale è essenziale per sviluppare trattamenti efficaci per il glaucoma.
I modelli animali di glaucoma sono essenziali per studiare le malattie fisiopatologia e di identificare e testareterapeutica promettente. La crescente disponibilità di linee di topi transgenici compresi i ceppi knockout condizionali e topi portatori traccianti fluorescenti geneticamente codificati ha spinto la necessità di modelli murini glaucoma inducibile. Diversi modelli di roditori di glaucoma sono stati sviluppati nel corso degli anni (recensiti a 2,3). In molti di questi modelli, il glaucoma è indotta interrompendo dinamiche nell'umore acqueo, con conseguente aumento della IOP. Modelli occlusione, in cui microsfere o altre sostanze vengono iniettate nella camera anteriore dell'occhio per bloccare il drenaggio acquosa, hanno guadagnato popolarità negli ultimi anni in parte grazie alla loro relativa facilità di aumentare IOP 4-14.
Il modello microbead occlusione del glaucoma, prima effettuata in primati 12, conigli 8, e ratti 4,9,11, è stato recentemente adattato per l'uso in topi 5,6,10. In questi studi, l'iniezione intracameral di microsfere di polistirolo, da solo o incombinazione con un materiale viscoelastico, ha provocato IOP elevazione che porta alla successiva morte 6,10 RGC. Tuttavia, reflusso quando l'ago viene ritirato dall'occhio e sloggiare di microsfere dall'angolo iridocorneale sono i problemi più comuni che si presentano durante la procedura. Per minimizzare questi inconvenienti, i magneti sono stati utilizzati per ottenere microsfere magnetiche all'angolo iridocorneale dell'occhio 4,9.
Il protocollo qui descritto è una procedura modificata sulla base di studi precedenti 9,10 che utilizza microsfere magnetiche e un magnete palmare atta ad occhio mouse (Figura 1). Diversi importanti modifiche sono state introdotte nel nostro protocollo per garantire aumento IOP efficace e riproducibile in topi. In primo luogo, l'iniezione di microsfere viene fatto utilizzando un microago vetro preparato con cura con uno smusso sfaccettato. Le superfici lisce conseguenti del microago così come la sua punta affilata assicura che danno minimo èinflitto come perfora la cornea. L'uso di questo microago vetro comporta anche un maggiore controllo quando la punta microago entra nella camera anteriore, riducendo così il rischio di danneggiare le strutture circostanti, come l'iride e la lente. Inoltre, la piccola lesione corneale iniezione facilita autoriparazione e riduce gli effetti di pregiudizio relativi indesiderati.
In secondo luogo, l'iniezione di microsfere magnetiche e l'uso di un magnete palmare consentono un controllo preciso per attirare i talloni verso l'angolo iridocorneale nell'occhio piccolo topo. microsfere magnetiche che sono 4,5 micron di diametro sono stati utilizzati perché questa dimensione microperla non intasare l'apertura microneedle preparata e, soprattutto, una volta iniettato, queste microsfere hanno bloccato efficacemente il drenaggio dell'umor acqueo. Questo approccio non solo riduce il reflusso delle microsfere iniettati, ma assicura anche che un numero massimo di microsfere accumula nella zona di destinazione di bloccare efficacemente il drenaggio dell'umore acqueo. Furthermore, questa strategia riduce anche il numero di perline galleggianti nella camera anteriore evitando il contatto con altre strutture, come l'iride e la lente, e il passaggio impedendo alla camera posteriore. Collettivamente, queste modifiche assicurano che la chirurgia iniezione microbead viene eseguita con relativa facilità e in modo tempestivo conseguente induzione altamente riproducibile, efficace e costante di ipertensione oculare nei topi.
La tecnica video presentato qui fornisce dettagliate istruzioni passo-passo su come eseguire l'iniezione intracameral di microsfere magnetiche per indurre in modo efficace e riproducibile IOP elevazione nei topi. Questa procedura si traduce in aumento della pressione intraoculare sostenuto che non necessita di ulteriori iniezioni e promuove rilevabile soma RGC e la perdita di assoni entro le prime 3 settimane di ipertensione oculare induction.Elevated IOP è un importante fattore di rischio per lo sviluppo di glaucoma negli esseri umani. Pertanto, questa è una murino oculare modello di glaucoma ipertensione-dipendente prezioso che ha il potenziale per una vasta gamma di applicazioni.
Un inconveniente comune associato con l'iniezione di microsfere nella camera anteriore riferisce a tallone reflusso attraverso il sito di iniezione quando l'ago viene ritirato, il che si traduce spesso in solo parziale ostruzione acquosa e una maggiore variabilità. Per risolvere questo problema, sono state attuate diverse modifiche importanti. Firs t, l'accurata preparazione di un ambiente pulito, microago vetro tagliente di smusso sfaccettato è essenziale per l'iniezione di successo delle microsfere. Un microago adeguatamente preparato consente penetrazione controllata e liscia della cornea con una minima applicazione di pressione alla superficie oculare delicata. La piccola puntura corneale impedisce il riflusso di microsfere. Inoltre, la multa microneedle riduce il rischio di danneggiare strutture vicine, come l'iride e la lente, che potrebbe tradursi in infiammazione correlati non-malattia. In secondo luogo, l'applicazione di un magnete palmare per aree oculari strategiche durante e dopo l'iniezione è un altro aspetto critico di questa tecnica. Durante l'iniezione, il magnete viene utilizzato per disegnare le microsfere magnetiche alla camera prevenire il reflusso anterior delle microsfere quando il microago viene ritirata. Dopo l'iniezione, il magnete viene poi utilizzato per indirizzare le microsfere all'angolazione iridocorneale di bloccare deflusso dell'umore acqueo.
tenda "> Un altro problema spesso incontrate nei modelli di occlusione microperla è che le iniezioni ripetute perline sono spesso necessari per raggiungere sostenuta IOP elevazione 10,11. Questo potrebbe essere il risultato di microperle sloggiare dal punto di vista iridocorneale con il tempo. La combinazione di un magnete palmare, come descritto sopra, e il posizionamento del mouse postoperatorio migliora notevolmente il risultato. l'uso di anestetici iniettabili, che consentono flessibilità per spostare la testa durante la procedura e richiedono un periodo di recupero più lungo post-operatorio, è favorito. posizionamento dello mouse con l'occhio operato rivolta verso l'alto per un paio d'ore dopo l'intervento contribuisce alla composizione di microsfere con l'angolo iridocorneale e diminuisce il rischio di sloggiare indietro nella camera anteriore.Garantire che il numero di perline iniettato è relativamente costante è un altro passo fondamentale per ridurre al minimo le variazioni inter-animale. Dal momento che le microsfere depositano presso il Bottom del tubo, è necessario omogeneizzare pienamente la soluzione microbead e prelevare il volume appropriato nel microago in modo tempestivo. L'iniezione di un minor numero di perline nella camera anteriore potrebbe causare il blocco incompleta delle strutture di drenaggio dell'umore acqueo, che è suscettibile di provocare scarsa o variabile elevazione IOP. Da segnalare, anche se il fine ultimo di iniezione microperla è quello di elevare la IOP, si deve usare cautela quando le misurazioni IOP da topi svegli sono superiori ai valori di picco riportati in questo studio (~ 25 mmHg). Estremamente elevati IOP aumentano il rischio di danno ischemico e possono anche causare dolore all'animale. L'elevazione della IOP dovrebbe essere considerata come uno dei molti fattori per valutare il successo della chirurgia. Come tale, il risultato della procedura deve essere misurata sulla base di diversi parametri tra cui elevazione IOP, morte soma RGC, e perdita di assoni.
Anche se il protocollo qui descritto si traduce nella maggior microsfere successoly sedimentazione all'angolo, un potenziale limitazione di questo modello è che quelle gocce che rimangono galleggianti in camera anteriore potrebbero interferire con l'imaging della retina vivo attraverso la cornea, così come saggi elettrofisiologiche e comportamentali che richiedono efficace passaggio della luce. Un altro aspetto importante da considerare quando si utilizza questo modello dell'occlusione microperla è che il grado di elevazione IOP e successiva degenerazione RGC varia con l'età e background genetico del mouse operato [4]. Pertanto, l'estensione della IOP elevazione e la timeline di RGC degenerazione dovranno essere determinati per ogni specifica linea di topo transgenico e / o fascia di età.
Una caratteristica di questo modello è che i risultati IOP elevata in un graduale perdita della morte RGC durante le prime tre settimane dopo l'iniezione microperla, e significativa la morte RGC è accertata in 3 settimane dopo la procedura. Pertanto, questo modello consente l'esame delle modifiche precoci e / o sottili che si verificano in questa disease, prima di Overt RGC soma e la perdita di assoni. Un significativo aumento nella morte RGC non è stata osservata tra 3 e 6 settimane dopo l'induzione di ipertensione oculare. Infatti, RGC soma e assone perdita rimasto stabile a ~ 22 – 25% tra 3 e 6 settimane a dispetto di successo e sostenuta IOP elevazione questi punti temporali. Una durata più lunga di sostenuta IOP può essere richiesto per ulteriore perdita RGC a verificarsi in C57BL / 6 topi, che sembrano essere più resistente ai danni RGC rispetto ad altri ceppi di topi. 5 modifiche aggiuntive al protocollo presentato qui, tra cui la regolazione della dimensione del tallone e ulteriori iniezioni, potrebbero essere necessari per studiare la perdita di RGC in momenti successivi. Pertanto, il nostro protocollo è ideale per studi si sono concentrati sui primi cambiamenti fisiopatologici che correlano con modesto neurodegenerazione RGC che sono rilevanti per insorgenza e la progressione precoce nel glaucoma umana.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Puller | Narishige | PC-10 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
Ketamine | Controlled substance | ||
Xylazine | Bayer Healthcare | ||
Acepromazine | Vetoquinol | ||
U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
Balance | Ohaus | CS 200 | |
Buprenorphine | Controlled substance | ||
Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
Dissection tools | |||
Small brush | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
Aluminum foil | |||
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |