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免疫与感染

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Published: February 12, 2016
doi:
10.3791/53658
, , , ,
1Ischemia Research Unit,Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Fraunhofer Research Institution for Marine Biotechnology,University of Lubeck, 3Department of Neurology,University of Leipzig

Summary

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Abstract

El accidente cerebrovascular isquémico inicia una respuesta inflamatoria robusta que comienza en el compartimiento intravascular e implica la activación rápida de las células residentes cerebro. Un mecanismo clave de esta respuesta inflamatoria es la migración de las células inmunes circulantes en el cerebro isquémico facilitado por la liberación de quimioquinas y el aumento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial. leucocitos cerebro-invasor son bien conocidos por contribuir a las primeras etapas de la lesión isquémica secundaria, pero su importancia para la terminación de la inflamación y la reparación cerebral después sólo recientemente se ha notado.

Aquí, se proporciona un protocolo simple para el aislamiento eficiente de células inmunes desde el cerebro isquémico ratón. Después de la perfusión transcardial, hemisferios cerebrales se diseccionaron y se disocian mecánicamente. La digestión enzimática con Liberase es seguido por gradiente de densidad (tales como Percoll) centrifugación para eliminar la mielina y los restos celulares. Una gran ventaja de este protocolo is el procedimiento de gradiente de densidad de una sola capa, que no requiere preparación requiere mucho tiempo de gradientes y se puede realizar de forma fiable. El enfoque produce el recuento de células altamente reproducibles por los hemisferios cerebrales y permite la medición de varios paneles de citometría de flujo en un replicar biológica. Caracterización fenotípica y cuantificación de leucocitos cerebro-invasor después del accidente cerebrovascular experimental pueden contribuir a una mejor comprensión de sus papeles multifacéticos en la lesión isquémica y reparación.

Introduction

ictus cerebral desencadena una respuesta inflamatoria sostenida que se inicia rápidamente después de la interrupción del flujo sanguíneo local y consiste en prácticamente todas las partes del sistema inmune. Un sello distintivo importante de esta respuesta inflamatoria es una afluencia temporizada de las células inmunes en el cerebro que es accionada por la activación de células endoteliales del cerebro, la secreción de quimioquinas sustancial y una mayor salida simpática 1-3. Infiltración de células inflamatorias se consideraba anteriormente deletéreo en el ictus isquémico, sin embargo, varios ensayos de tratamiento diseñados para bloquear de manera indiscriminada salida de leucocitos al cerebro no inducir un beneficio clínico medible 4. Más recientemente, se hizo evidente que las células derivadas de monocitos inicialmente implicados en la progresión del daño isquémico 5 también podrían desempeñar un papel fundamental para la resolución de la inflamación y el tejido de reparación posterior 6.

Gracias a la identificación de fenotípica y functional heterogeneidad entre los monocitos y macrófagos, los conocimientos sobre la función de los fagocitos mononucleares en el desarrollo y la resolución de la inflamación se ha expandido de manera significativa. En ratones, los monocitos circulantes se pueden clasificar en al menos dos subconjuntos funcionalmente distintos de acuerdo con su expresión en la superficie de antígeno de linfocitos 6 complejo (Ly-6C) 7. Mientras Ly-6C altos monocytes''inflammatory fueron claramente demostrado ser esencial para el control de infecciones bacterianas 8, su papel en la lesión estéril es más controvertida. En el accidente cerebrovascular isquémico, la ablación selectiva de CCR2 + Ly-6C altos monocitos resultó en la transformación hemorrágica del infarto 6. Sin embargo, el mismo enfoque experimental mejoró la discapacidad aguda después de la hemorragia intracerebral 9. Del mismo modo, se cree que los diferentes subconjuntos de células T, ya sea para ejercer acciones perjudiciales 10 o de protección 11 en la lesión cerebral isquémica, sin embargo, los datos son controversiAL 12,13 y ser objeto de nuevas investigaciones. Dada esta complejidad creciente, se hace evidente que el conocimiento más profundo sobre las funciones de las diversas células inmunes en la lesión isquémica y la reparación es crucial para traducir los resultados experimentales en terapias dirigidas a la inflamación después del accidente cerebrovascular.

Hoy en día, la más poderosa herramienta para el análisis de la respuesta inmune celular es policromática citometría de flujo. Permite la identificación y cuantificación de los diversos subconjuntos de células inmunes en el sitio de la inflamación sin la necesidad de empujar el sistema por medio del etiquetado in vivo o manipulación genética 14. Tinción simultánea de los marcadores de la superficie celular con anticuerpos contra citoquinas intracelulares 15 o factores de transcripción 16 proporciona, además, información sobre el estado funcional de las células individuales, fenotípicamente identificados. Como una desventaja importante, se requieren suspensiones de células individuales para ensayos de citometría de flujo y por lo tanto información sobre loclización de los infiltrados celulares se pierde. Sin embargo, aunque la histología es ideal para obtener información espacial, que está limitado por el número de anticuerpos que se puede utilizar en una sola vez para caracterizar los subtipos de células inmunes en un tejido particular. Hoy en día, se necesita una combinación de la presencia y ausencia de diversos marcadores de superficie para identificar sin ambigüedad subconjuntos de células inmunes raras, especialmente las poblaciones de células derivadas de monocitos durante la inflamación distintas 17.

A continuación, describimos un protocolo eficiente para aislar un gran número de leucocitos desde el cerebro postisquémica ratón usando un simple gradiente de densidad de una sola capa. Las suspensiones de células obtenidas pueden ser analizadas por cualquiera de flujo multidimensional o más citometría ser enriquecidas mediante clasificación de citometría de flujo o la selección inmunomagnética para realizar análisis posteriores altamente específicas. El método de perfusión transcardial detalles, la eliminación de los hemisferios cerebrales, la disociación del tejido cerebral en susp una sola célulaensiones, centrifugación en gradiente de densidad para la eliminación de la mielina, así como la tinción de anticuerpos para el análisis de citometría de flujo.

Protocol

Todos los experimentos con animales deben ajustarse a las normas de acuerdo para el cuidado de animales (por ejemplo., La Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud, NIH Publication No. 85-23 estadounidenses, versión revisada en 1996) y tienen que ser aprobados por la autoridad estatal correspondiente. 1. Preparación de los reactivos Tampón de digestión (1 ml por hemisferio): disolver una mezcla estandarizada de enzimas digestivas purificados, por ejemplo, Liberase con la concentración de termolisina bajo (TL) hasta una concentración de 2 U / ml en Hanks Balanced que contiene calcio de Salt Solution (HBSS) (Ca) y magnesio (Mg) Tampón de lavado con DNasa: Disolver ADNasa I a una concentración de 666U / ml en HBSS (Ca / Mg libre) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) Tampón de lavado sin DNAsa: HBSS (Ca / Mg libre) que contiene 10% de FCS medio de gradiente de densidad (5 ml por cada hemisferio): se prepara Stock gradiente de densidad isotónica0; medio (SIP; 100%) mediante la mezcla de nueve partes de medio de gradiente de densidad con una parte de cloruro de sodio 1,5 M. Diluir SIP a la densidad de 25% mediante la adición de un volumen apropiado de HBSS (Ca / Mg libre) que contiene 3% de FCS La citometría de flujo tampón (FC): Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 3% de FCS 2. transitoria cerebral media oclusión de la arteria NOTA: la oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) a través de la técnica de sutura intraluminal se realizó como se ha descrito previamente 18 en 12 semanas de edad C57BL / 6 ratones. En pocas palabras, anestesiar a los ratones con 2,0% de isoflurano en oxígeno al 100%. Se mantiene la temperatura corporal a 36,5 ° C ± 0,5 ° C por un dispositivo de calentamiento de retroalimentación controlada. Después de la ligación de la arteria carótida común y la arteria carótida externa, introducir un monofilamento recubierto de silicona-caucho estandarizado en la arteria carótida común y hacerlo avanzar al origen de la mitad cerebral arteria. Después de 45 min eliminar el filamento para permitir la reperfusión. En los animales con operación simulada, retirar inmediatamente el filamento después de la oclusión de la arteria cerebral media para evitar la isquemia. 3. transcardial de perfusión cerebral y disección Preparar una bomba de perfusión peristáltica mediante la inmersión de un extremo de la tubería en HBSS enfriado con hielo (Ca / Mg libre). Fijar una aguja de 23 G contundente para el otro extremo del tubo de perfusión y encender la bomba para llenar completamente el tubo con HBSS (Ca / Mg libre). Profundamente anestesiar al ratón con 4% de isoflurano y la eutanasia por inhalación de CO2. Coloque dorsal del ratón sobre una tabla de disección incrustado en una bandeja de plástico. tanto la propagación y patas traseras lo más amplio posible y fijar en el tablero de disección con 20 agujas G. Coge la piel del abdomen con una recta 1 x 2 dientes pinzas y se utilice tijeras afiladas iris para hacer una incisión lateral a través del tegumento y la pared abdominal y exponer lahígado. Levantar el esternón y la incisión en el diafragma con la cuchilla roma del iris tijeras afiladas / romos. Continuar el corte de la caja torácica lateral en ambos lados en la dirección caudocraneal. Tenga cuidado de no lesionar el pulmón, el corazón y las arterias torácicas. Levantar el colgajo de piel con unas pinzas romas y el pin en el tablero de la disección. Utilice unas tenazas sin filo y tijeras para separar cuidadosamente el corazón del tejido conectivo. Mantenga corazón con unas pinzas de punta roma e inserte la punta de la aguja roma 23 G con el tubo de perfusión se adjunta en el ápex del ventrículo izquierdo. Nota: No inserte la aguja demasiado lejos en el ventrículo izquierdo para evitar lesiones del tabique interventricular. Si es necesario, fijar la cánula en su lugar con un fórceps rectos afilados. Incisión en la aurícula derecha con unas tijeras afiladas iris y gire inmediatamente a la bomba (caudal: 8 – 10 ml / min). Continuar la perfusión hasta que el hígado presenta un color café claro (~ 30 ml de HBSS). En todola perfusión, evitar cuidadosamente cualquier formación de burbujas de aire en el tubo. Decapitar al ratón con tijeras quirúrgicas rectas justo detrás del cráneo. Utilice tijeras iris para hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo. Coloque una punta del iris tijeras afiladas en el foramen magnum y cortar lateralmente en el cráneo. Repite por el otro lado. Use las tijeras iris afilado para cortar cuidadosamente de la misma cavidad hasta la línea media hacia la nariz. Trate de mantener el extremo de la tijera tan superficial como sea posible para evitar lesiones del cerebro. Utilice unas pinzas finas para pelar suavemente los huesos del cráneo de cada hemisferio cerebral. Nota: tejido infartado puede adherirse a las meninges o el cráneo; asegurarse de no perder el tejido cerebral debido a la disección imprudente Levante el cerebro con una espátula y utilizar tijeras afiladas iris para diseccionar cuidadosamente las fibras de los nervios craneales que lo fijan al cráneo. Coloque el cerebro en un tubo de 15 ml lleno con 10 ml de HBSS (+ Ca / Mg) y mantenerla esoco en hielo. 4. La disociación de Tejido Cerebral en suspensiones celulares individuales Retirar con cuidado el tallo cerebral y el cerebelo con una hoja de afeitar limpia. Utilice una hoja de afeitar limpia para hemisect el cerebro y cortar cada hemisferio a lo largo del plano coronal en tres trozos de aproximadamente el mismo tamaño. Pique diseccionó tejido de cada hemisferio a través de un filtro de células de 100 micras usando el extremo del émbolo de una jeringa de 5 ml. Continuamente enjuagar el filtro de células con HBSS enfriado con hielo (+ Ca / Mg). Almacenar muestras homogeneizadas en hielo. Centrifugar a 286 xg y 4 ° C durante 5 min, descartar el sobrenadante cuidadosamente. Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de digestión y transferir la suspensión a un tubo de 2 ml. Se incuba la suspensión bajo rotación lenta y continua a 37 ° C durante 1 hora. suspensión celular a través de un tamiz de 70 micras filtro de células y enjuague a fondo con 3 ml de tampón de lavado que contenía ADNasa seguido por 15 ml de tampón de lavado libre de DNasa. Centrifugar a 286 xg y 18 ° C durante 5 min y descartar el sobrenadante. Nota: Nota: El uso de DNAsa elimina el moco ADN causado por la lisis celular que podría conducir a la agregación de células comprometer la supervivencia celular. 5. La centrifugación por gradiente de densidad para la eliminación de la mielina y los desechos celulares Resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio de gradiente de densidad de 25% y la pipeta la suspensión a un tubo de 15 ml. Mezcle bien con la repetida y suave pipeteo evitando la formación de burbujas. Nota: medio de gradiente de densidad se debe utilizar a temperatura ambiente para evitar la formación de grumos de células. Centrifugar a 521 xg y 18 ° C durante 20 min. Utilice perfil de aceleración más bajo del rotor y permitir que el rotor se detenga sin freno. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga sin agitación. aspirar con cuidado la capa de mielina y el sobrenadante mientras que preserva el sedimento celular en el fondo del tubo. Nota: Asegúrese de eliminar toda la capa de mielina que cualquier sobrante será impaiAnálisis de citometría de flujo r. Resuspender el precipitado en 10 ml de tampón de lavado libre de DNAsa y pipetear la suspensión a un nuevo tubo de 15 ml. Nota: Esta etapa de lavado es crucial ya que la eliminación suficiente de medio de gradiente de densidad contribuye significativamente a la cantidad y calidad de la muestra de células final. Centrifugar de nuevo a 286 xg y 10 ° C durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de tampón de lavado frío y determinar los recuentos de células y la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro. Conservar las muestras a 4 ° C y más procesarlos con rapidez. 6. tinción de anticuerpos para el análisis de citometría de flujo Antes de etiquetado de anticuerpos, se incuba la suspensión celular a 4 ° C durante 10 min con CD16 anti-murino / reactivo de bloqueo CD32 FC-Receptor (concentración final de 2,5 g / ml, factor de dilución 1: 200) para evitar la unión no específica. Añadir anticuerpos primarios fluoróforo conjugado en la unaconcentración apropiadas, con (como se indica en la Tabla 1) a la suspensión celular y se incuba a 4 ° C durante 20 min en la oscuridad. Nota: Las muestras de control no se tiñen con anticuerpos primarios, pero tratadas de modo igual. Lavar las células con 2 ml de tampón de FC y centrifugar a 350 xg y 10 ° C durante 7 min.Carefully aspirar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 200 l de tampón de FC. Almacenar las muestras temporalmente a 4 ° C en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo. 7. La cuantificación absoluta de contar bolas Inversamente pipetear 40 l de tampón de FC y 10 l de la suspensión celular en un tubo de conteo que contiene un número conocido de perlas fluorescentes. Nota: Tener en cuenta que las pipetas están calibradas para entregar exactamente 10 l de muestra como el cálculo subsiguiente de los recuentos de leucocitos se refiere a este volumen. Incubar suspensión de células con el anticuerpo CD45 marcado con FITC (concentración finalde 5 mg / ml, factor de dilución 1: 100) a 4 ° C durante 20 min en la oscuridad. A la inversa llenar el tubo de conteo con 200 l de buffer de FC sin ninguna etapa de lavado y grabar directamente las células CD45 + en el citómetro de flujo. 8. Adquisición de citometría de flujo Nota: Para analizar el panel de anticuerpos propuesta, el citómetro apropiada ha de estar equipado con un color azul (488 nm), rojo (635 nm) y violeta (405 nm) láser y filtros para FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 y AmCyan. Ajuste frontal (FSC) y de dispersión lateral (SSC) mediante el uso de células no teñidas de un hemisferio isquémico. Discriminar dobletes de células individuales en un gráfico de puntos que muestra el área y la altura de FSC. Muestra todas las células individuales en histogramas de un solo parámetro para cada canal de fluorescencia utilizado y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) tensiones de manera que las células individuales se muestran en el extremo izquierdo del histograma. Utilice una sola CD45-FITCmuestra teñida para verificar los parámetros de dispersión y PMT para las células de interés por backgating células inmunes altos CD45 en cada histograma y gráfico de dispersión. Nota: Adaptar tensiones PMT de FITC para que CD45 negativo, intermedio (int) y las células que expresan altos pueden ser diferenciados unos de otros. Utilizar anticuerpos capturados bolas de compensación para realizar la compensación de múltiples colores. Establecer puertas de la microglía (int) CD45 y CD45 leucocitos (alta) y, posteriormente, definir subpoblaciones de leucocitos de acuerdo con la estrategia de compuerta que se muestra en la Figura 1.

Representative Results

La isquemia cerebral se inició en 12-semanas de edad C57BL / 6 ratones a través de la oclusión filamento transitoria de la arteria cerebral media izquierda (MCAO). Para operación simulada se insertó el filamento para ocluir la arteria cerebral media izquierda y se retira inmediatamente para permitir la reperfusión inmediata. Es importante destacar que la neuroinflamación celular difiere sustancialmente entre los modelos de aplicación común de accidente cerebrovascular 19. Esto tiene que ser tenido en cuenta especialmente cuando se extrapolan los resultados de estudios en animales para la fisiopatología del accidente cerebrovascular heterogénea humana. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después de la MCAO para analizar la invasión de células inmune temprana en el cerebro isquémico. Los recuentos de células obtenidas a partir del hemisferio isquémico (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) después de la centrifugación en gradiente de densidad fueron comparables a los del hemisferio contralateral (MCAO contraindicaciones; 1,09 ± 0,30 x 10E6) y el ipsilateralhemisferio de los ratones con operación simulada (ipsi farsa; 1,12 ± 0,18 x 10E6, ANOVA de una vía, p = 0,524). La viabilidad de las células aisladas medidos por exclusión de azul de tripano fue alta y no difirió significativamente entre los grupos (sham 96.85 ± 0.60%, MCAO Contra 97.12 ± 1.18%, MCAO IPSI 95.68 ± 2.04%, unidireccional ANOVA, p = 0,253 ). La composición del cerebro infiltrarse 24 horas después de la MCAO se determinó mediante análisis de citometría de flujo. La figura 1 ilustra esquemáticamente la estrategia de gating (A) y en un animal de accidente cerebrovascular representativo (B). Leucocitos infiltrantes cerebrales se definen como células CD45 altas que se pueden diferenciar de CD45 microglia int. Dentro de la alta población CD45, neutrófilos polimorfonucleares (PMN) se identificaron mediante la expresión Ly-6G, mientras que los linfocitos T se delinearon como CD45 alto células CD3 +. El resto de células de alta CD45 fueron entonces distinguencado por CD19 (linfocitos B) y la expresión de CD11b. La fracción CD11b + se subdivide además en Ly-6C alta `monocytes` inflamatoria y una baja población Ly-6C que abarca monocitos, células dendríticas (DC) y los macrófagos. En la fase aguda del accidente cerebrovascular, las células inmunes mieloides dominan el cerebro infiltrarse 3,20. Los neutrófilos entran en el cerebro rápidamente después de la oclusión de los vasos y promueven la extravasación de monocitos inflamatorios 21. Figura 2A muestra el porcentaje de aumento de LY6-G + neutrófilos en el hemisferio isquémico 24 horas después de la MCAO en comparación con la cirugía y la falsa hemisferio contralateral. Por el contrario, la proporción de células T CD3 + en el hemisferio isquémico es (relativamente) más baja que en el cerebro sano. Dentro de la población CD11b +, isquemia cerebral desplaza el equilibrio hacia una fuerte preponderancia de monocitos inflamatorios elevados Ly-6C (figura2B). Además de distribuciones relativas, se utilizaron tubos de recuento para determinar el número absoluto de subconjuntos de células inmunes en muestras en la base de eventos CD45 positivos (Figura 3). tubos de conteo contienen un sedimento liofilizado que libera un número conocido de perlas fluorescentes. El número absoluto de células positivas en la muestra puede determinarse mediante la relación eventos celulares a talón eventos. Para calcular el número de CD45 altas leucocitos por hemisferio se utilizó la siguiente ecuación: pilas de gran CD45 por hemisferio = (CD45 altos eventos x contar bolas / eventos muestra de perla total) x (volumen de suspensión total (100 l) / volumen de la muestra (10 l )). 24 horas después de la MCAO, los recuentos de leucocitos totales en el hemisferio del infarto se incrementaron significativamente en comparación con el hemisferio contralateral y la cirugía simulada (Figura 3D, un modelo lineal, p = 0,0004). Cargos de la di subconjuntos de células inmunes instinto (PMN, células T, células B, Ly-6C alta y Ly-6C bajas monocitos) pueden ser fácilmente calculan multiplicando su frecuencia relativa con el número total de leucocitos de alta CD45 de la muestra respectiva. Figura 1. Estrategia de apertura de puerta para citometría de flujo. (A) Representación esquemática de la estrategia de compuerta. (B) muestra el análisis de citometría de flujo de los leucocitos aislados de un representante de cerebro de ratón 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. FSC dispersión hacia adelante, PMN neutrófilos polimorfonucleares, células dendríticas clásicas CDC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/> Figura 2. Diferenciación de inmunes subconjuntos de células. Distribución relativa de Ly-6G + -neutrophils (A), las células T CD3 + (A) y subconjuntos de monocitos identificados por la expresión diferencial de Ly-6C (B) en el ipsilateral (ipsi) y contralateral ( Contra) hemisferio 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) o una cirugía simulada respectiva. Porcentaje de cada población se indica en la puerta. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. La cuantificación de leucocitos cerebrales mediante recuento de los granos. (A) muestra la puerta del grano altamente doble positivo. Dentro de la población única célula (B) CD45 int microglía puede ser diferenciada de alta leucocitos CD45 (C). Para la cuantificación, el número de gated altos eventos CD45 se normalizó a los eventos de talón contados. Tenga en cuenta que los leucocitos totales (CD45) altos recuentos se incrementaron significativamente en el hemisferio ipsilateral (IPSI) en comparación con el contralateral (contra) la cirugía simulada hemisferio y 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 por ANOVA de una vía y Tukey`s prueba post hoc de comparaciones múltiples. n = 4-6 por grupo. FSC dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. fluorocromo FITC EDUCACIÓN FÍSICA PerCP PC7 <td rowlapso = "2"> APC-Cy7 V500 (Cy5.5) Antígeno CD45.2 CD3 Ly-6G CD19 Ly-6C CD11b La concentración final [g / ml] 5 1 0,2 0,2 1 1 Factor de dilución 1/100 1/200 1 / 1.000 1 / 1.000 1/200 1/200 Clon 104 145-2C11 1A8 6D5 AL-21 M1 / 70 1. Mesa de cóctel de anticuerpos básico de la célula inmune de identificación en el cerebro isquémico.

Discussion

A continuación, describimos un método simple y eficaz para el aislamiento de los leucocitos desde el cerebro murino después del accidente cerebrovascular experimental. El enfoque produce de forma fiable los recuentos de células altamente reproducibles por el hemisferio cerebral que permite medir diferentes paneles de flujo en un replicar biológica.

Al parecer, una eliminación incompleta de las células inmunes, incluyendo la sangre dará lugar a una visión distorsionada de la cantidad real de células inflamatorias que entró en el cerebro isquémico. Por lo tanto, cuando se utiliza este protocolo de prestar especial atención a la perfusión transcardial a fondo para evitar la contaminación de las células inmunes infiltrado con leucocitos circulantes no inflamatorias. Por experiencia, el uso de agujas romas para punción ventrículo izquierdo reduce el riesgo de lesión del septo interventricular que pasar por alto la perfusión de la circulación sistémica. Aparición de líquido de perfusión de las fosas nasales es una señal de que la perfusión pressureis demasiado alto, por lo tanto, unavelocidades de flujo de vacío> 10 ml / min. Pálido a blanco el color del tejido cerebral indica buena perfusión mientras que el color rosado es un signo de mala perfusión.

Otro paso crítico de este protocolo es la disociación eficiente de tejido cerebral que comprende la fragmentación mecánica, así como la digestión enzimática. Picado del tejido a través del filtro de células es fundamental para conseguir una eficacia mejorada de las proteasas. Sin embargo, cuando la homogeneización de los tejidos, evitar la presión excesiva como fagocitos mononucleares son altamente susceptibles a la autolisis 22. Para la digestión enzimática Liberase TL se recomienda que es una mezcla de colagenasa I altamente purificado y II que contiene bajas concentraciones de la termolisina proteasa neutra. La comparación directa con los protocolos de aislamiento descritos anteriormente 14,22,23, significativamente más altas de recuperación de células viables mediante tratamiento Liberase TL (KM datos no publicados). En comparación con la colagenasa, que es el uso frecuented para el aislamiento de células del sistema inmune del cerebro, Liberase TL contiene niveles insignificantes de endotoxina. Esto es de importancia especial si se clasifican las células para el análisis de aguas abajo debido a los altos niveles de endotoxina podrían cambiar el estado de activación de las células inmunes 24 y severamente deteriorar los resultados de cultivo de células 25. Otro inconveniente de la colagenasa tradicional Es significativo diferencias de lote a lote en las actividades enzimáticas y pone en peligro la reproducibilidad de los resultados y requiere la determinación de la concentración de trabajo para cada lote 26.

En el cerebro adulto, la eliminación de mielina por centrifugación en gradiente de densidad es un paso indispensable para aplicaciones posteriores tales como citometría de flujo o más estudios sobre expresión de genes o proteínas. Una ventaja importante del protocolo es el procedimiento de la densidad de una sola capa que no requiere preparación tiempo de gradientes. Por otra parte, el protocolo de separación produce resultado fiables, incluso cuando es realizada por los experimentadores más inexpertos. Está desprovisto de los gradientes de capas con densidades cerca uno del otro que son difíciles de pipeta sin molestar a la interfaz en el medio.

Sobre la base de la expresión del marcador de superficie CD45, el protocolo produce tres categorías principales de células en el cerebro isquémico. La gran mayoría de las células pertenecen a una población negativa CD45 que se compone de células neuronales, astroglia, ependimarias y células endoteliales. Su abundante presencia se atribuye al gradiente de densidad de una sola capa que tiene como objetivo principalmente a la mielina eficiente y remoción de escombros. Además, una población CD45 int que representa la microglía residente 27 puede ser diferenciada de una alta población CD45 que contiene principalmente leucocitos infiltrantes hematógena. Sin embargo, hay que señalar que la microglia activada puede adoptar el fenotipo y la función de las células mieloides nacido sangre. Por lo tanto, sólo se aplica sofisticadod técnicas tales como parabiosis 28, quimeras de médula ósea 29 o el análisis suerte de cartografía 30 permite una distinción clara entre estas dos poblaciones durante la inflamación.

Análisis de los datos de citometría de flujo se limita a menudo a la distribución porcentual de las poblaciones de células específicas. Sin embargo, cuando se compara el infarto hemisferio para el tejido cerebral no infartada esta información puede ser engañosa porque no tiene en cuenta el recuento total de leucocitos cerebro que son modificados por la lesión isquémica. Por lo tanto, para dibujar una imagen completa de la magnitud y el fenotipo de los infiltrados inflamatorios después del accidente cerebrovascular distribución relativa de los subconjuntos de células inmunes debe complementarse con número absoluto de células. Al usar microperlas como se describe en este protocolo, el pipeteado de un volumen preciso de la muestra es absolutamente obligatorio para obtener resultados fiables. Por otra parte, el pipeteado inverso es muy recomendable para evitar la formación de espuma en el tubo de conteo. Surjan burbujas de airereducirá el volumen previsto de microperlas y por lo tanto dar lugar a una sobreestimación de los recuentos de leucocitos CD45 alta en la muestra.

En resumen, este protocolo proporciona un enfoque sencillo y fiable para aislar las células inmunes del cerebro. Puede servir como una herramienta valiosa para diseccionar la complejidad de la respuesta inflamatoria a un accidente cerebrovascular isquémico. Las aplicaciones futuras incluyen investigaciones sobre el papel dependiente del tiempo de subconjuntos de monocitos en la propagación y la resolución de la inflamación cerebral isquémico. Del mismo modo, la función del sistema inmune adaptativo después del accidente cerebrovascular es poco conocido. Análisis citométrico de flujo subpoblaciones de células T identificados por la expresión de factores de transcripción-subconjunto específico o citoquinas in situ podría ayudar a clarificar su impacto en la recuperación a largo plazo después del accidente cerebrovascular y prometedoras vías abiertas tanto para el desarrollo de nuevos enfoques de tratamiento.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Isabell Schulz por su excelente apoyo técnico.

Materials

Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel World precision instruments PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2 incubator  Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+ Thermo Scientific
FACS Canto II Becton Dickinson
Isoflurane Abbott 4831850
Hank's buffered salt solution (HBSS) Gibco/Life Technologies GmbH 14175-129
HBSS with Calcium/Magnesium Gibco/Life Technologies GmbH 24020-091
Liberase TL Roche Diagnostics GmbH 5401020001 use at room temperature
Percoll Plus GE Healthcare Europe GmbH 17-5445-01
Fetal bovine serum  PAN Biotech 3302-P101003
Trypan blue Gibco/Life Technologies GmbH 15250-061
Trucount BD Biosciences 340334
Phosphate buffered saline Biochrom AG L 182-10
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 11284932001
CD11b Horizon V500 BD Biosciences 562128
CD16/CD32 eBioscience 14-0161
CD45.2 FITC eBioscience 11-0454
CD3 PE Biolegend 100307
CD19 PE-Cy7 Biolegend 115519
Ly6C APC-Cy7 BD Biosciences 560596
Ly6G PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560602
Silicone Tubing, 1m World precision instruments 503022
Fine Iris Scissors sharp Fine Science Tools 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools 14130-17
Fine Iris Scissors sharp/blunt Fine Science Tools 14028-10
Straight 1×2 teeth forceps Fine Science Tools 11021-14
Blunt-end Forceps Fine Science Tools 11008-13
5ml syringe plunger Carl Roth GmbH (Braun) EP96.1
Cell strainer, 100µm Dr. I. Schubert, BD 2360-00
Omnican Fine dosage syringe 1ML Braun TBD
Cell strainer, 70µm Greiner Bio-One GmbH 542 070
FACS Tubes BD Bioscience GmbH 352052
serological pipettes, 10ml Greiner Bio-One GmbH 607180
serological pipettes, 10ml Sarstedt AG&Co 861,254,025
serological pipettes, 25ml Greiner Bio-One GmbH 760180
serological pipettes, 5ml Greiner Bio-One GmbH 606180
serological pipettes,25ml Sarstedt AG&Co 861,685,020
serological pipettes,5ml Sarstedt AG&Co 861,253,025
Tips, 0,1-10µl Corning B.V.Life Sciences 4840
Tips, 100-1000µl Greiner Bio-One GmbH 740290
Tips, 10-200µl Greiner Bio-One GmbH 739296
Reaction tubes 1,5ml Greiner Bio-One GmbH 616201
Reaction tubes 2ml Greiner Bio-One GmbH 623201
Bacteriological petri dish, 94x16mm Greiner Bio-One GmbH 633180
Falcon 15ml Greiner Bio-One GmbH 188271
Falcon 50ml VWR International GmbH (BD) 734-0448
Neubauer hemocytometer Biochrom AG PDHC-N01
razor blade Carl Roth GmbH CK07.1
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References

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Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (108), e53658, doi:10.3791/53658 (2016).
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