Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

L'embrione di topo preimpianto è un paradigma per studiare la formazione e il mantenimento della pluripotenza in vivo, così come un modello per lo studio della determinazione del fato cellulare e de novo epitelizzazione nei mammiferi. Le fasi preimpianto dello sviluppo dei mammiferi sono dedicati alla creazione di tre linee cellulari che compongono la blastocisti, vale a dire la epiblasto pluripotente – che dà luogo alla maggior parte dei tessuti somatici e le cellule germinali – e due linee extraembrionali, il trophectoderm (TE) e la endoderma primitivo (PRE) (Figura 1A) ^1,2. Questo protocollo descrive le procedure per (1) embrioni raccolta e fissare fase preimpianto del mouse, (2) eseguire immunofluorescenza per etichettare le proteine ​​di interesse, (3) effettuare tutto il montaggio di immagini utilizzando un microscopio confocale con funzionalità di z-sezionamento e (4) eseguire la segmentazione nucleare di immagini confocale e analisi successive immagine quantitativa. Questo gasdotto permette tegli imparziali misurazione dei livelli di proteine ​​per l'assegnazione delle identità cellulari per caratterizzare le sottopopolazioni di cellule in situ. Questo protocollo può essere eseguito in meno di 3 – 4 giorni per una singola cucciolata (generalmente fino a 10 embrioni di topo), dalla raccolta embrione per l'analisi dei dati (Figura 1B). L'analisi simultanea di più cucciolate aumenterebbe l'imaging e analisi di dati in tempo onere, estendendo così la lunghezza complessiva del protocollo.

L'embrione preimpianto fase del mouse è un sistema sperimentale trattabili che, data la sua piccola dimensione e morfologia stereotipata ^3, è adatto per l'imaging in toto di processi cellulari con risoluzione di una singola cellula. Per effettuare un imparziale, analisi a livello di sistema di un numero statisticamente rilevante di embrioni, un sistema automatico, pipeline di analisi quantitativa è desiderabile. Tuttavia, a causa della elevata densità nucleare della massa cellulare interna (ICM) della blastocisti ( <strong> Figura 1A, 2D), piattaforme immagine segmentazione convenzionali non riescono a fornire una sufficiente precisione per stabilire un flusso di lavoro automatizzato o semi-automatizzato. D'altra parte, la segmentazione manuale, mentre accurate, non consente l'elaborazione di grandi coorti di cellule ed embrioni, né è adeguato riproducibile, determinazione imparziale delle identità cellulari – che è particolarmente importante quando si studiano stadi di sviluppo in cui i modelli di marcatore espressione non ha completamente risolto (ad esempio, non presentano una distribuzione binaria in una popolazione). Abbiamo recentemente sviluppato e validato un metodo di segmentazione delle immagini su misura per gli embrioni palco del mouse preimpianto e per le cellule staminali embrionali di topo (CES), che raggiunge un'elevata accuratezza, mentre richiede un input minimo dell'utente ^4-8.

Il gasdotto analisi presentata qui ruota attorno lo strumento segmentazione delle immagini MATLAB a base modulare interattivo Segmentazione Nucleare (minuti) ^4. MIN performs segmentazione nucleare senza supervisione su grandi lotti di confocale Z-stack dopo che l'utente ha stabilito un numero minimo di proprietà dell'immagine, utilizzando un'interfaccia utente grafica (GUI) (Tabella 1) ^4. Questo oleodotto si è dimostrato efficace per la generazione di dati ad alto rendimento sulla espressione di proteine ​​e localizzazione cellulare in entrambi wild-type, sperimentalmente trattati e gli embrioni e CES ^5-7 geneticamente modificati. Nel presente protocollo, si descrive l'applicazione di minuti alla segmentazione di immagini dell'embrione preimpianto stadio. Per esempi di prestazioni minuti sul CES si rimanda al ^4,7. La fase di segmentazione nucleare automatizzato riduce notevolmente l'onere tempo del processo di identificazione delle cellule, mentre le misure di intensità spaziale e fluorescenza consentono una determinazione imparziale delle identità delle cellule e la generazione di mappe tridimensionali di domini di espressione genica e la posizione delle cellule nell'embrione (Figura 1C </strong>). Inoltre, la scalabilità di questo flusso di lavoro rende applicabile all'analisi dei singoli cucciolate attraverso grandi coorti di embrioni trattati sperimentalmente, o embrioni di diverso background genetico ^5,6. Minuti è liberamente disponibile presso http://katlab-tools.org (il software richiede una licenza MATLAB).

Nessun approccio sviluppato fino ad oggi consente la generazione di tali dati in modo approfondito l'espressione proteica e la localizzazione delle cellule in embrioni di topo preimpianto. Tutti i tentativi finora a quantificare questi tipi di dati sono stati limitati alla determinazione manuale e quantificare la presenza di numeri di cellulare per le diverse popolazioni nell'embrione (o interamente a mano, o software-assistita) ^9-19. Questo approccio (che incorpora il software minuti) è stata adattata per e testato su embrioni preimpianto mouse e CES; tuttavia la sua prestazione su altri sistemi con elevata densità nucleare, anche se ancora sottoposti a verifica, dovrebbe essere equivalente.