Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Die Maus preimplantation Embryo ist ein Paradigma die Entstehung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vivo zu untersuchen, sowie ein Modell für die Untersuchung von Zellschicksal Spezifikation und de novo Epithelisierung in Säugetieren. Die preimplantation Stadien der Entwicklung von Säugetieren sind für die Errichtung der drei Zelllinien her, die zur Blastozyste ausmachen, nämlich die pluripotenten Epiblasten -, die zu den meisten somatischen Geweben und Keimzellen gibt – und zwei extraAbstammungsLinien, die Trophektoderm (TE) und der primitive Endoderm (PRE) (1A) ^1,2. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren (1) Ernte und Präimplantationsstadium Mausembryonen zu beheben, (2) durchführen Immunfluoreszenz-Proteine ​​von Interesse zu kennzeichnen, (3) durchzuführen ganze-mount-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop mit z-Schnittfunktionen verwenden und (4) Kern Segmentierung von konfokalen Bildern durchführen und die anschließende quantitative Bildanalysen. Diese Pipeline erlaubt ter unvoreingenommene Messung der Proteinspiegel für die Zuordnung von Zellidentitäten Subpopulationen von Zellen in situ zu charakterisieren. Für einen einzigen Wurf (in der Regel bis zu 10 Maus-Embryonen) vor 4 Tagen, von Embryo-Entnahme zur Datenanalyse (Abbildung 1B) – Dieses Protokoll kann in weniger als 3 durchgeführt werden. Die gleichzeitige Analyse mehrerer Würfe würde die Bildgebung und Datenanalysezeit Belastung erhöhen, wodurch die Gesamtlänge des Protokolls erstreckt.

Die Präimplantationsstadium Mausembryo ist ein experimentell handhabbar System, das aufgrund seiner geringen Größe und stereotypen Morphologie ^3, geeignet ist, auch für in toto Imaging von zellulären Prozessen mit Einzelzellauflösung. Um eine unvoreingenommene, Systemebene Analyse einer statistisch relevanten Anzahl von Embryonen durchgeführt werden, eine automatisierte, ist die quantitative Analyse Pipeline wünschenswert. Aufgrund der hohen Kerndichte von der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten ( <stRong> 1A, 2A), versagen herkömmliche Bildsegmentierung Plattformen ausreichender Genauigkeit, um eine automatische oder halbautomatische Arbeitsablauf zu schaffen. Auf der anderen Seite, manuelle Segmentierung, während genau, erlaubt es nicht, die Verarbeitung großer Kohorten von Zellen und Embryonen, noch ist es geeignet für eine reproduzierbare, objektive Bestimmung von Zellidentitäten – was besonders wichtig ist, wenn Entwicklungsstadien studiert, wo Muster von Marker Ausdruck noch nicht vollständig gelöst (zB keine binäre Distribution über eine Bevölkerung aufweisen). Wir haben vor kurzem ein Bild Segmentierungsverfahren zugeschnitten für Maus Präimplantationsstadium Embryonen und embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen), die eine hohe Genauigkeit erreicht, während erfordert nur minimalen Benutzereingaben ^8.4 entwickelt und validiert.

Die Analyse Pipeline hier vorgestellten dreht sich um die MATLAB-basierte Bildsegmentierung Werkzeug Modular Interactive Kernsegmentierung (MIN) ^4. MINS performs unbeaufsichtigt Kernsegmentierung auf große Chargen von konfokalen Z-Stapel, nachdem der Benutzer eine minimale Anzahl von Bildeigenschaften hergestellt ist, eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) (Tabelle ^{1) 4} verwendet wird. Diese Pipeline effizient zur Erzeugung von Hochdurchsatz-Daten auf die Proteinexpression und Zellortung sowohl in Wildtyp erwiesen hat, experimentell behandelt und genetisch Embryonen und WSR ^7.5 geändert. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Minuten, um die Segmentierung von preimplantation stufigen Embryo Bilder. Beispiele für MINS Leistung auf WSR verweisen wir auf ^4,7. Die automatisierte Kernsegmentierungsschritt reduziert die zeitliche Belastung der Zelle Identifikationsprozess, während die räumlichen und Fluoreszenzintensitätsmessungen eine unvoreingenommene Bestimmung von Zellidentitäten und die Erzeugung von dreidimensionalen Karten der Genexpression Domänen und Zellenposition in dem Embryo (Abbildung ermöglichen 1C </strong>). Darüber hinaus ermöglicht die Skalierbarkeit dieses Workflows anwendbar es um die Analyse der einzelnen Würfe durch die großen Kohorten von experimentell behandelten Embryonen oder Embryonen von unterschiedlichen genetischen Hintergründe ^5,6. MIN ist bei http://katlab-tools.org (die Software erfordert eine MATLAB Lizenz) frei verfügbar.

Kein Ansatz bis heute entwickelt erlaubt die Erzeugung solche eingehende Daten auf die Proteinexpression und Zellortung in Maus Präimplantationsembryonen. Alle Versuche, die bisher in dieser Art von Daten zu quantifizieren sind für verschiedene Bevölkerungsgruppen in den Embryo (entweder völlig manuell oder softwaregestützt) ^9-19 auf die manuelle Ermittlung und Quantifizierung von Zellzahlen beschränkt. Dieser Ansatz (unter Einbeziehung der MIN-Software) wurde auf Maus Präimplantationsembryonen und WSR zugeschnitten für und getestet; trotzdem seine Leistung auf anderen Systemen mit hoher Atomdichte, obwohl noch nicht erprobt, wird voraussichtlich gleichwertig zu sein.