Una batería de pruebas de motor en un modelo de ratón neonatal de la parálisis cerebral

NOTA: Todas las cirugías animales se realizaron de acuerdo con el departamento de ULAR de la Universidad de Temple y las políticas y procedimientos del IACUC. C57BL / 6 presas y los toros fueron adquiridos de Charles River Laboratories y se alojaron en jaulas de cría con un / ciclo de luz de 12 horas de oscuridad (luz sobre 07:00-19:00) con acceso libre a comida y agua. Las parejas reproductoras producen camadas de entre 5 – 10 crías. Cirugía 1. Parálisis Cerebral Inducción NOTA: La parálisis cerebral fue inducida mediante día postnatal (PND) 6 crías de ratón, como se ha descrito previamente 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia). Coloque un cachorro en un recipiente de vidrio en el hielo con un laboratorio trapo para proteger la piel del cachorro. Compruebe para el plano anestésico adecuado por pizca pie y la falta de movimiento. Mueva el cachorro a una bolsa de hielo acolchada para la cirugía. Esterilizar la piel del cachorro utilizando etanol al 70%. Una vez seco, utilizar un bla quirúrgico estéril # 11de y hacer una incisión de 1 cm en el cuello. El uso de un microscopio quirúrgico estereoscópico, aislar la arteria carótida común derecha con un pequeño gancho y cauterizar el uso de un cauterizador portátil de mano. confirmar visualmente que la arteria se ocluye. cirugía simulada incluye la visualización y el aislamiento de la arteria carótida común sin cauterización. Vuelva a alinear la piel y cerca usando sutura pegamento (n-butil cianoacrilato). Coloque el cachorro en una almohadilla térmica o 34 C durante 30 min para monitorizar la respiración espontánea y el movimiento normal. Devolver el cachorro (s) de la presa durante 30 minutos. Coloque los cachorros en una almohadilla eléctrica u otro dispositivo de calentamiento fijado en 34 ° C en el interior de una cámara de hipoxia fijado en el 6% de oxígeno durante 35 minutos. El oxígeno se sustituye por nitrógeno. Vigilar de cerca el nivel de cámara de oxígeno y la temperatura para obtener resultados consistentes de lesiones. Retire los cachorros de la cámara de hipoxia y devolverlos a la resistencia de calentamiento. Intraperitoneal inyectar lipopolysacárido diluye en solución salina estéril a 1 mg / kg y volver al cachorro a la presa. inyecciones simuladas son inyecciones de solamente solución salina. 2. Las pruebas de motor Neonatal NOTA: El PND 8, 48 horas después de la inducción CP, crías de ratón se prueban para el desarrollo neuroconductual. Los cachorros se ponen a prueba dentro de un bloque de 4 horas antes del mediodía con el fin de eliminar el tiempo de las diferencias en el comportamiento del día. Los cachorros se eliminan de la presa por no más de 15 min a la vez para impedir la pérdida rápida de problemas de calor del cuerpo y el hambre / separación. Además, los cachorros se les permite descansar entre las pruebas para que los esfuerzos máximos se suscitó en cada prueba. La base de las pruebas de motor neonatales está adaptado usando la batería de pruebas de Fox 10,11 y adaptación de las pruebas de Fox 12 de Wahlsten, así como las publicaciones TREAT-NMD y otros comportamientos (como se señala en el texto para cada prueba). La batería del zorro de las pruebas son apropiadas para PND 2 – 21. De las pruebas de Fox, el bateadorY aquí presentes incluyen: reflejo de enderezamiento, agarrando reflejo, geotaxis negativos (llamados prueba de pantalla vertical en la batería de Fox) y la fuerza de prensión de cuatro extremidades (modificado a partir de pruebas de escalada pantalla de Fox y de Wahlsten). Aquí, la deambulación, la fuerza delante de las extremidades, y la fuerza de las extremidades posteriores también se prueban para distinguir el comportamiento motor reflexiva entre el simulacro y el ratón CP cachorros. Para eliminar las mejoras en las pruebas debido al aprendizaje, las pruebas se limitan a un máximo de 3 ensayos donde se indique. Todas las otras pruebas tuvieron sólo un ensayo por animal. Deambulación (Figura 1) (adaptado de un protocolo de rata 13): NOTA: El rastreo es un comportamiento desarrollado a principios de la cría de ratón entre el PND a 0 – 5, en el que los ratones comienzan a punto de transición a caminar, a partir de 5 – 10 días de edad 14. En PND 8, la prueba de deambulación se aprovecha de esta evolución en el tiempo de transición. La locomoción puede, sin embargo, se anotó durante toda la vida de un ratón y se puede determinar a cualquier edad.Como no hay potencial para el aprendizaje, la prueba de la deambulación se puede repetir tantas veces como sea necesario a través del curso del experimento. ratones lugar en un recinto claro que los ratones son visibles desde la parte superior, así como el lado. Utilice punzada suave al tocar la cola del cachorro para motivar al cachorro a caminar. Puntuación deambulación durante 3 minutos utilizando la siguiente escala: 0 = ningún movimiento, 1 = movimiento de las extremidades que se arrastra con asimétrica, 2 = rastreo lento movimiento de las extremidades, pero simétrica, y 3 = rastreo rápido / pie. NOTA: Aquí, movimiento de las extremidades simétrico se describe en las patas traseras se encuentran frontpaws durante cada paso, y cada paso sin problemas las transiciones a la siguiente etapa. Un ratón se presentan movimiento de las extremidades asimétrica tiene la colocación de la pata errático y transiciones de una etapa a la siguiente no son suaves. Figura 1. La transición deSe arrastra al caminar puede distinguirse mediante la observación de la pata trasera, así como la cabeza y la cola. (A) Durante el rastreo, la pata trasera entera, desde los dedos hasta el talón, toca el suelo al caminar, como se indica mediante (*). Una forma de andar de adultos sólo se ve cuando los dedos de los pies y la parte delantera de la pata trasera tocan el suelo (el talón es elevado, por deonoted [**]). (B) La cabeza y la cola de un ratón que se arrastra es bajo a la tierra. La cabeza empieza a subir durante la transición de gatear a caminar. La transición es completa cuando tanto la cabeza y la cola son elevados y sólo la parte delantera de la pata trasera toque el suelo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Del miembro posterior del pie de ángulo (Figura 2) NOTA: Hay un cambio en el desarrollo de manifiesto en la postura de las extremidades posteriores como el mouse madura de gatear a caminar, en donde los miembros traseros están colocados debajo del cuerpo al caminar y el ángulo entre la patas traseras es menor que el ángulo se ve en el rastreo. A pesar de que el ángulo del pie del miembro posterior cambia con el tiempo, crías de ratón de la misma edad con diferentes lesiones o enfermedades pueden ser comparados. De manera similar a la prueba de deambulación (3.1), no hay potencial para el aprendizaje. Por lo tanto, la prueba de ángulo del pie del miembro posterior se puede repetir tantas veces como sea necesario a través del curso del experimento. Ya sea en una caja de campo abierto claro o un área cerrada, montar una cámara de vídeo desde debajo o por encima, respectivamente, para registrar el cachorro medida que se mueve alrededor del campo. Utilice punzada suave al tocar la cola del cachorro para motivar al cachorro a caminar. Registro durante dos minutos. El uso de las grabaciones de vídeo, medir su ángulo de las crías al trazar una línea desde el extremo del talón / espinilla hasta la punta de los más largos del dedo del pie (en el centro). Sólo tomar la medición cuando el cachorro está realizando una zancada completaen una línea recta y los pies estén bien apoyados en el suelo. No tome mediciones, mientras que el cachorro está parado o mientras que el cachorro está girando. Medir tres a cinco series de ángulos para los pies y calcular el ángulo promedio para cada cachorro probado. Figura 2. miembro posterior del pie en ángulo puede ser utilizado para determinar la marcha anormalidades. El ángulo del pie puede medirse trazando una línea desde mediados del talón a través del dígito medio (el más largo). Los animales heridos tienen un ángulo de pie mayor cuando se compara a la normalidad (ver resultados representativos, Pie de ángulo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El enderezar la superficie (Figura 3): NOTA: El reflejo de enderezamiento es la capacidad del motor para una cría de ratón para ser capaz de dar la vuelta en sus pies desde una posición supina. La edad media para el reflejo de enderezamiento a aparecer en roedores es PND 5 con un rango de PND 1 -. 10 15 Como esta prueba es un reflejo, no hay componente de aprendizaje y puede repetirse a lo largo del período de experimentación. Coloque las crías a la espalda sobre una almohadilla de hoja de algodón o un banco y mantenga en su posición durante 5 segundos. Liberar las crías y registrar el tiempo que tarda el cachorro para volver a la posición en decúbito prono, así como la dirección de enderezamiento (izquierda o derecha). Se da un total de un minuto para cada ensayo, si es necesario. Repita para un total de tres ensayos. Figura 3. superficial de enderezamiento. Esta prueba requiere el control del tronco y puede probar los desequilibrios posturales. los pacientes con PC humanos pueden tener déficits en su núcleo.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Negativo geotaxis (Figura 4) NOTA: La edad media de reflejo geotaxis negativa a aparecer en los roedores es PND 7 con un rango de PND 3 – 15 15 La prueba geotaxis negativo evalúa la coordinación motora en ratones jóvenes.. Los ratones se colocan mirando hacia abajo de una pendiente y, debido a las señales vestibulares de la gravedad, las crías se vuelven a enfrentar por la pendiente. La respuesta al estímulo, o los taxis, es un comportamiento innato. Coloque el cachorro con su cabeza apuntando hacia abajo en una pendiente de 45º y mantenerla durante 5 seg. Liberar al cachorro y registrar el tiempo y la dirección que el cachorro se gira para mirar hacia arriba. El tiempo total de la prueba es de 2 min. Repita para un total de tres ensayos. Los ratones que caen por la pendiente o no se encienda puede ser re-probado, eliminado, o dado una puntuación de cero. NOTA: Esta decisión es lEFT para el examinador, ya que ocasionalmente cachorros rodará por la pendiente, debido a la somnolencia y no de debilidad. Una vez que se toma la decisión sobre la forma de puntuación cachorros que caen por la pendiente, debe tenerse en cuenta en los métodos y debe ser consistente durante toda la prueba de todos los sujetos. Figura 4. Negativo geotaxis. Motor y la entrada vestibular se requiere para el ratón para reconocer su orientación en una pendiente y dar la vuelta. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Suspensión delantera de las extremidades (Figura 5) 16; adaptado de 17, 18: NOTA: Suspensión delantera de las extremidades a prueba la fuerza de la extremidad anterior de las crías, incluyendo la fuerza del brazo y la pata. Tsu prueba no se recomienda para cachorros menores de 10 PND 15. Los cachorros se les permite captar un alambre suspendidos encima de un objeto estable y colgar en el cable con las dos patas delanteras. El área de pruebas es a través de una zona de arrastre acolchada. La prueba puede detectar diferencias de fuerza lateral derecha / izquierda. El aprendizaje y la ausencia de refuerzo negativo puede conducir a un aumento de la no participación. Los ratones que caen inmediatamente si se suelta o el fracaso de comprender cuando se coloca en el cable son indicativos de la no participación. Mantenga los cachorros con firmeza por el cuerpo y que puedan captar el hilo con las dos patas delanteras. Liberar al cachorro. El uso de un contador de tiempo o cronómetro, grabar el tiempo total a caer, así como la debilidad de la pata. NOTA: debilidad de la pata se determina si un cachorro disminuye de forma del cable con una pata antes que el otro lugar de la liberación del cable con las dos patas al mismo tiempo. Repita la prueba para un total de tres veces. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figura 5. frontal del miembro de suspensión. Esta prueba de suspensión provoca tensión en las patas delanteras hasta que la fatiga muscular. Con este enfoque, se estableció la fuerza de línea de base en las extremidades anteriores. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Suspensión posterior (Figura 6): NOTA: Esta prueba determina la fuerza de las extremidades posteriores de suspensión. Es una prueba diseñada específicamente para los recién nacidos y se utilizó inicialmente en animales entre PND 2-12 19,20, pero puede ser adaptado para ratones hasta PND 14. Esta prueba puede detectar diferencias derecha / izquierda de fuerza los miembros posteriores, así como la función neuromuscular. Se utiliza un estándar cónica 50 ml, rellena con toallitas de laboratorio. Al igual que en la prueba de suspensión delantera de las extremidades, esta prueba puede ser aprendido, sobre todo pecadoce no hay ninguna consecuencia negativa al caer. Por lo tanto, el aumento de la no participación, como se ve por los ratones que caen tan pronto como se presenta o el fracaso para alojarse cuando se coloca en el extremo del tubo, se puede notar. El uso de un cónico de 50 ml, lugar cachorro suavemente boca abajo en el tubo con sus patas traseras colgaban por encima del borde. Liberar al cachorro. Observar la postura de las extremidades posteriores. Puntuación postura de acuerdo con los siguientes criterios. NOTA: puntuación de 4 indica la separación normal de las extremidades posteriores con la cola levantada; puntuación de 3 significa debilidad es aparente y extremidades posteriores están más cerca juntos, pero que rara vez se tocan; puntuación de 2 indica extremidades posteriores están cerca unos de otros y, a menudo conmovedora; puntuación de 1 muestra una debilidad es aparente y los miembros posteriores son casi siempre en una posición entrelazadas con la cola levantada; una puntuación de 0 indica que abrocha constante de las patas traseras con la cola bajada o imposibilidad para mantener en el tubo para cualquier período de tiempo. Conde tira si es necesario. Un tirón es qualified cuando el cachorro intenta levantar su cuerpo usando sus patas traseras mientras está suspendido en el lado del tubo cónico. El uso de un temporizador o cronómetro, registra la latencia a caer. Repetir todo el ensayo por triplicado. Figura 6. suspensión posterior. (A). Esta prueba de suspensión provoca tensión en los miembros posteriores hasta la fatiga muscular. La fuerza de línea de base y la postura de los miembros traseros son establecidas. (B). Scoring. Tenga en cuenta los números por encima de los ratones representativos que demuestran la puntuación posible postura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La fuerza de prensión (Figura 7): NOTA: Este ensayo examinará la pata strength de las cuatro patas al mismo tiempo. Se utiliza un cable de pantalla de 16 x 18 de fibra de vidrio. La edad media de un roedor que sea capaz de captar una pantalla horizontal es PND 8 con un rango de PND 5 – 15 15 Fox utilizó la prueba de la pantalla horizontal de cuatro extremidades del PND 2 -.. 21 10 Esta prueba es una modificación de la norma horizontal prueba de pantalla; aquí la pantalla se gira lentamente desde una posición horizontal a la posición vertical, para desafiar a la captación de las cuatro extremidades 21; adaptado de Corti S 16. Si el ratón se aferra a la pantalla de malla cuando se invierte a 180 °, grabar la latencia a caer. Además, tenga en cuenta el peso corporal. Un impulso de colgar puede ser calculada como [peso (g) x latencia a caer (sec)] que refleja la fuerza necesaria para resistir la gravedad. El uso de un pedazo de tela metálica, coloque el cachorro en la pantalla. Deje que el cachorro a adaptarse a este ambiente durante aproximadamente 5 segundos. Invertir la pantalla lentamente a 180 grados. Registre el esp aproximadae de la pantalla cuando el cachorro se cae. Repita para un total de tres pruebas y el promedio de los ensayos. Se requiere la Figura 7. fuerza de agarre. Los ratones para mantener la tensión muscular en las cuatro extremidades como fuerza aumenta gravitacionales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aferramiento Reflex (Figura 8) NOTA: El reflejo de agarre por lo general aparece en roedores con PND 7 con un rango de PND 3 – 15 15 Cada pata se prueba individualmente, por tanto, la prueba puede revelar problemas frontal o las extremidades posteriores, así como cuestiones parcialidad.. Como es un reflejo, esta prueba se puede repetir hasta que aparezca el reflejo. No es propenso a aprender. Como una advertencia importante, esta prueba no distingue la fuerza de agarre, única habilidad, y debe ser probado antes de 15 días de edad en ratones jóvenes comienzan a captar debido al temor de la respuesta. Mantenga pulsado el ratón por la piel de su cuello, similar a la forma en que una cría de ratón se realiza por la presa. Esta posición hace que el cachorro se convierta en instintivamente inmóvil y relajado, lo que permite la facilidad de la prueba. Accidente cerebrovascular cada pata del perrito con el romo, redondeado lado de una hoja de afeitar. Pruebe cada pata individual y registrar la presencia o ausencia de agarre y una puntuación de 1 punto por cada pata con la que los agarra ratón. NOTA: El marcador para el derecho de preferencia de la pata es de 100% para el derecho de preferencia de la pata, – – -100% para la preferencia de la pata izquierda, 50% para las dos patas de agarre, y 0% para no patas prensiles. La ecuación para determinar estos números es [(pata derecha – pata izquierda) / (pata derecha + izquierda + pata ambas patas)] x 100%. /53569/53569fig8.jpg "/> Figura 8. Grasping Reflex. Debido a ratones recién nacidos no tienen una fuerte respuesta de miedo, esta prueba determina estrictamente el reflejo plantar / palmar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Acantilado Aversión (Figura 9): NOTA: pruebas de aversión Cliff laberinto reflejos, así como la fuerza y la coordinación y se pueden utilizar para probar las crías de PND 1-14 22. Un cuadro de pre-perfumada (una caja donde se ha permitido un mínimo de 5 ratones para vagar libremente) con una repisa elevada plana se utiliza y el cachorro se coloca con los dígitos solamente de sus patas delanteras y su hocico colocada sobre el borde. La puntuación se realizó contando el tiempo total que tarda el cachorro a alejarse del acantilado y mover sus patas y el hocico fuera del borde. Si no se observa respuesta después de 30 segundos, se termina la prueba.Si el cachorro se cae del borde, un único ensayo adicional se puede realizar. Usando una vista lateral, colocar el cachorro en el borde de la caja de pre-perfumado, asegurándose de que las patas delanteras, dígitos y el hocico son las únicas partes sobre el borde. Liberar las crías y comenzar temporizador. Una vez que tanto el hocico y las patas se han eliminado desde el borde, detener el tiempo del temporizador y registro. Repita la prueba para un total de 3 ensayos. Si el cachorro no se mueve lejos del acantilado dentro de 30 segundos, no se da una puntuación. NOTA: La determinación de si el cachorro es un no-participante frente deteriorados se deja a la discreción del examinador. La altura del acantilado puede ser ajustada para la edad del cachorro para garantizar la seguridad del cachorro. A menor altura se puede utilizar con un "piso" negro de emular una altura mayor. figur9. desequilibrios e acantilado Aversión. vestibulares se miden mediante la prueba de la aversión al acantilado. Aquí, los ojos del cachorro están todavía cerrados por lo que el miedo no es el factor que impulsa a alejarse de la orilla del acantilado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Significación estadística El uso de un software estadístico analizar los resultados. Expresar los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Las pruebas son paramétricas y, por tanto, examinar los datos mediante análisis de la prueba t. NOTA: Los experimentos no fueron diseñados para probar las diferencias de género. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p <0,05.