JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Een batterij van Motor Tests in een neonatale muis-model van Cerebral Palsy

Published: November 03, 2016
doi:
10.3791/53569
,
1Department of Medical Genetics and Molecular Biochemistry,Lewiz Katz School of Medicine at Temple University, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center

Summary

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Abstract

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Introduction

Het ontwikkelen van nieuwe modellen van pediatrische letsel of ziekte met behulp van knaagdieren is vaak moeilijk te wijten aan de geweldige mogelijkheid van zowel ratten en muizen om snel te herstellen van neurologisch letsel. Daarom, om eventuele nieuwe pediatrische ziekte model, grondig onderzoek van de cellulaire en moleculaire veranderingen moeten hand-in-hand met behavioral resultaten gaan valideren. In veel opzichten, kan functionele behavioral herstel belangrijker dan de onderliggende cellulaire veranderingen in termen van therapeutische of translationele belang zijn. Als onderzoekers meer informatie over letsel bij volwassen en pasgeboren blijkt dat hun reacties zijn zeer verschillend en kunnen niet worden geëxtrapoleerd tussen de twee. Bijvoorbeeld, neonatale muizen tonen verschillende zenuwgroeifactor, BDNF, neurotrofine-3 en gliale cellijn afgeleide neurotrofe factor na ruggenmergletsel 1,2. Bovendien, pasgeborenen hebben belangrijke bloed-hersenbarrière lekkage na een beroerte 3, demonstrate corticale neuron omlegging na perifere zenuwen letsel 4, en hebben een vertraagde of vertraagd astrogliosis na dwarslaesie en hypoxie-ischemie 5,6. Daarom is het belangrijk dat translationeel onderzoek pediatrisch gebruik ontwikkelingsgebied gelijkwaardige modellen en dat deze modellen geëvalueerd op zowel cellulaire / moleculaire veranderingen en leeftijd aangepaste gedragstesten.

Cerebral Palsy (CP) is een motorische stoornis die 3 beïnvloedt: 1000 levendgeborenen per jaar (NIH). Kinderen met CP vertonen diverse symptomen en co-morbiditeit, afhankelijk van de ernst van de ziekte. Moeilijkheid met beweging en coördinatie zijn de meest voorkomende symptomen, samen met vertragingen in het bereiken van motorische mijlpalen in de ontwikkeling. Andere symptomen zijn abnormale spiertonus (verhoogd of verlaagd), verminderde fijne motoriek, moeite met lopen, overmatig kwijlen en slikken, en spraak vertragingen (NIH). De onderliggende oorzaak van CP wordt aangenomen dateen gebrek aan zuurstof en / of de bloedstroom naar de hersenen tijdens de pre- of peripartumperiode of binnen één jaar post-partum. Bovendien wordt ontsteking nu beschouwd als een belangrijke stap in de ontwikkeling van CP zijn.

De meerderheid van de CP gevallen worden geassocieerd met witte stof schade rond de ventrikels, die bekend staat als Periventriculaire Leukomalacie (PVL). Deze neurologische stempel suggereert dat de initiële insult waardoor CP optreedt tijdens de ontwikkeling van de hersenen bij de oligodendrocyten het meest kwetsbaar zijn insult. De periode van snelle groei oligodendrocyten bij een mens, ook de periode waarin oligodendrocyten het meest gevoelig voor schade, tussen 24-32 weken zwangerschap. In het knaagdier, de overeenkomstige periode is postnatale dagen 2-7 juli, en is wanneer CP wordt geïnduceerd in dit model.

De neonatale muismodel van CP die werd gebruikt om de hier beschreven tests combineert hypoxie en ischemie met ontsteking een inj creërenury dat beter bootst de neurodegeneratie gezien in humane CP. Dit model wordt een aantal van de belangrijkste tekortkomingen die in andere dierlijke modellen van CP, waarvan tekorten afzonderlijke motor die menselijke CP patiënten lijkt, maar ook afzonderlijke witte stof schade ontbreken. Eerdere studies door een medewerker met hetzelfde model hebben aangetoond dat de toevoeging van ontsteking verbetert witte stof schade, dus beter emuleren PVL waargenomen bij kinderen met CP 8. Voortbouwend op de eerdere gegevens, dit document presenteert een uitgebreide batterij van neonatale motortesten om veranderingen in de motorische gedrag als het dier leeftijden te evalueren.

Protocol

LET OP: Alle dierlijke operaties werden uitgevoerd in overeenstemming met ING VAN afdeling Temple University en IACUC beleid en procedures. C57BL / 6 dammen en stieren werden gekocht bij Charles River Laboratories en werden ondergebracht in kweekkooien met een 12 uur licht / donker cyclus (licht op 7:00-19:00) met vrije toegang tot voedsel en water. Broedparen produceerde nest maten tussen 5-10 pups. 1. Cerebral Palsy Inductie Surgery LET OP: Cerebrale parese werd geïnduceerd met behulp van postnatale dag (PND) 6 muis pups, zoals eerder beschreven 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia). Plaats een pup in een glazen kom op ijs met een laboratorium doekje om de huid van de pup te beschermen. Controleer op de juiste verdoving vliegtuig te voet pinch en gebrek aan beweging. Verplaats de pup naar een gewatteerde ijspak voor een operatie. Steriliseer de huid van de pup gebruik 70% ethanol. Wanneer het droog is, gebruik dan een # 11 steriele chirurgische blade en maak een 1 cm incisie in de nek. Met behulp van een stereoscopische chirurgische microscoop, isoleren van de juiste gemeenschappelijke halsslagader met een kleine haak en cauterize behulp van een draagbare hand-held cauterizer. Visueel bevestigen dat de slagader wordt afgesloten. Sham operatie omvat visualisatie en isolatie van de halsslagader zonder cauterisatie. Lijn de huid en in de buurt met behulp van hechtdraad lijm (n-butyl cyanoacrylaat). Leg de pup op een 34 o C verwarming pad gedurende 30 minuten om te letten op spontane ademhaling en de normale beweging. Zet de pup (s) tot de dam gedurende 30 min. Plaats de pups op een verwarmingselement of andere warming-apparaat ingesteld op 34 o C in een hypoxie kamer vastgesteld op 6% zuurstof gedurende 35 min. Zuurstof wordt vervangen door stikstof. Nauwlettend toezien op de kamer zuurstofgehalte en de temperatuur voor constante letsel resultaten. Verwijder de pups van de hypoxie kamer en breng ze terug naar de verwarming pad. Intraperitoneaal injecteren lipopolysaccharide verdund in steriele zoutoplossing bij 1 ug / kg en de terugkeer van de pup naar de dam. Sham injecties zijn injecties met alleen zoutoplossing. 2. Neonatale Motortests LET OP: Op PND 8, 48 uur na CP inductie, muis pups worden getest op neurogedragsontwikkeling. Pups worden getest binnen een 4 hr blok voor de middag met het oog op de tijd van de dag verschillen in gedrag te elimineren. Pups worden verwijderd uit de dam voor niet meer dan 15 minuten op een moment om snel verlies van lichaamswarmte en honger / scheiding problemen te voorkomen. Daarnaast worden pups mogen in rust tussen testen zodat maximale inspanningen worden opgewekt op elke test. De basis van de neonatale motortesten aangepast op batterijen Fox tests 10,11 Wahlsten en de aanpassing van de tests 12 Fox's, evenals Treat-NMD en ander gedrag publicaties (zoals in de tekst voor elke test). Fox's batterij van tests zijn geschikt voor PND 2 – 21. Van testen vos, het beslagy die hier aanwezig is inclusief: oprichtende reflex, grijpen reflex, negatieve geotaxis (de zogenaamde verticale screentest batterij Fox's) en vier ledematen knijpkracht (gemodificeerd van Fox en Wahlsten's screen klimmen tests). Hier worden ambulation, front-ledematen sterkte en kracht achterbeen ook getest reflexieve motorische gedrag tussen sham en CP muis pups te onderscheiden. Verbeteringen aan tests om leren te elimineren, werden proeven beperkt tot een maximum van 3 proeven anders vermeld. Alle andere tests hadden slechts één proef per dier. Ambulant (Figuur 1) (aangepast van een protocol rat 13): LET OP: Kruipen is een gedrag vroeg ontwikkeld in de muis pup tussen PND 0-5, op welk punt muizen beginnen om de overgang te lopen, 5-10 dagen oud 14. Bij PND 8, de ambulation-test maakt gebruik van deze overgangsperiode tijdsverloop. Ambulation kan echter worden gedurende de levensduur van een muis gescoord en kan worden vastgesteld op elke leeftijd.Aangezien er geen potentieel voor leren, kan de ambulation proef zo ​​vaak als nodig worden herhaald in de loop van het experiment. Plaats muizen in een duidelijke omhulsel waarin muizen zijn toegankelijk vanaf de bovenkant en de zijkant. Gebruik zachte porren door het aanraken van de staart van de pup om de pup te motiveren om te lopen. Score ambulation gedurende 3 minuten met behulp van de volgende schaal: 0 = geen beweging 1 = kruipen met asymmetrische beweging van de ledematen, 2 = langzaam kruipen, maar symmetrische beweging van de ledematen, en 3 = snel kruipen / lopen. OPMERKING: Hier wordt symmetrische beweging van de ledematen beschreven waarbij hindpaws voorpoten ontmoeten tijdens elke stap, en ieder vloeiend over naar de volgende stap. Een muis weergeven van asymmetrische beweging van de ledematen heeft grillig poot plaatsing en overgangen van de ene stap naar de volgende zijn rafelig. Figuur 1. De Overgang vanKruipen te lopen kunnen worden onderscheiden door observeren van de achterpoot, en de kop en staart. (A) tijdens kruipen, de gehele achterpoot, van de tenen tot de hiel de grond raakt wanneer ambulating, zoals aangegeven door (*). Een volwassen looppatroon wordt gezien als alleen de tenen en het voorste deel van de achterpoot de grond raken (de hiel is verhoogd, deonoted door [**]). (B) De kop en de staart van een kruipende muis is laag bij de grond. De kop begint te stijgen tijdens de overgang van kruipen te lopen. De overgang is voltooid wanneer zowel de kop en de staart zijn verhoogd en alleen de voorzijde van de achterpoot de grond raakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Voethoek achterpoot (figuur 2) LET OP: Er is een schijnbare ontwikkelingsstoornissen verandering in het achterbeen houding als het mouse rijpt van kruipen naar lopen, waarbij de achterpoten staan ​​onder het lichaam tijdens het lopen en de hoek tussen de achterpoten is dan de hoek gezien kruipen. Hoewel het achterbeen voethoek de loop der tijd verandert, kan de muis pups van dezelfde leeftijd met verschillende verwondingen of ziekten worden vergeleken. Vergelijkbaar met het ambulant-proef (3,1), is er geen potentieel voor leren. Aldus kan het achterbeen voethoek proef zo ​​vaak als nodig worden herhaald in de loop van het experiment. Hetzij in een heldere open veld box of een afgesloten ruimte, zet een videocamera in onder- of bovenaanzicht, respectievelijk de pup nemen als het beweegt rond het veld. Gebruik zachte porren door het aanraken van de staart van de pup om de pup te motiveren om te lopen. Record voor twee minuten. Via de beeldopnames, meet de voet hoek van de pups door een lijn vanaf het einde van de hiel / scheenbeen aan het uiteinde van het langste (midden) toe. Neem alleen de meting wanneer de pup is het uitvoeren van een volledige stridein een rechte lijn en beide voeten plat op de grond. Niet metingen terwijl de pup stilstaat of terwijl de pup draait. Meet 3-5 sets van mond hoeken en het berekenen van de gemiddelde hoek voor elke geteste pup. Figuur 2. achterbeen Foot hoek kan worden gebruikt om te bepalen Gait Afwijkingen. De voet hoek kan worden gemeten door het tekenen van een lijn uit het midden van de hiel door het midden (langste) cijfer. Gewonde dieren hebben een grotere voet hoek ten opzichte van normaal (zie Representatieve resultaten, Foot Hoek). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Oprichtreflex (Figuur 3): NB: De oprichtende reflex is de motor vermogen voor een muis pup te kunnen draaien op de voeten van een liggende positie. De gemiddelde leeftijd van de oprichtreflex moeten voorkomen knaagdieren PND 5 met een bereik van PND 1 -. 10 15 Aangezien deze test is een reflex, er geen leercomponent en kan gedurende de periode experimenten herhaald. Plaats de pups op hun rug op een katoenen doek of een bankje pad en in positie te houden gedurende 5 sec. Laat de pups en de tijd die de pup terug naar buikligging, evenals de richting van de oprichtreflex (links of rechts) opnemen. Een totaal van een min wordt gegeven voor elk onderzoek, indien nodig. Herhaal dit voor een totaal van drie studies. Figuur 3. Surface oprichtende. Deze test vereist romp controle en kunnen testen op posturale onevenwichtigheden. Human CP patiënten kunnen de tekorten in hun kern hebben.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Negatieve geotaxis (figuur 4) LET OP: De gemiddelde leeftijd voor negatieve geotaxis reflex om te verschijnen bij knaagdieren is PND 7 met een bereik van PND 3-15 15 De negatieve geotaxis-test beoordeelt de motorische coördinatie bij jonge muizen.. Muizen worden geplaatste naar beneden van een helling en, als gevolg van vestibulaire signalen van de zwaartekracht, pups wenden tot het gezicht van de helling. De respons op stimuli of taxi, een aangeboren gedrag. Leg de pup met zijn hoofd naar beneden op een 45 ° helling en houd deze 5 sec. Laat de pup en de tijd en de richting van de pup gaat naar boven onder ogen te nemen. De totale testtijd is 2 min. Herhaal dit voor een totaal van drie studies. Muizen die onderaan de helling valt of niet in te schakelen kan zowel re-getest, geëlimineerd, of krijgen een nul score. LET OP: Deze beslissing is left aan de examinator, zo af en toe pups naar beneden rollen de helling als gevolg van slaperigheid in plaats van zwakte. Zodra de beslissing is genomen over het scoren pups die onderaan de helling vallen, moet worden opgemerkt in de werkwijzen en consistent het testen van alle vakken moet zijn. Figuur 4. Negatieve geotaxis. Motor en evenwichtsstoornissen moet worden ingevoerd voor de muis om de oriëntatie op een helling te herkennen en rond te draaien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Front-ledematen Suspension (Figuur 5) 16; aangepast van 17, 18: LET OP: Front-ledematen schorsing test de voorpoot kracht van de pups, met inbegrip van arm en poot kracht. Tzijn test wordt niet aanbevolen voor pups jonger dan PND 10 15. Pups zijn toegestaan om een draad gespannen over een stabiel voorwerp te grijpen en hangen op de draad met beide voorpoten. Het testen gebied is meer dan een gewatteerde dropzone. De test kan rechts / links opzij sterkte verschillen te detecteren. Leren en de afwezigheid van negatieve versterking kan leiden tot verhoogde non-participatie. Muizen vallen direct bij het loslaten of het niet te begrijpen wanneer geplaatst op de draad zijn een indicatie van de niet-deelname. Houd de pups stevig door het lichaam en hen in staat stellen om de draad te grijpen met beide voorpoten. Laat de pup. Met behulp van een timer of een stopwatch, registreren de totale tijd vallen, evenals poot zwakte. OPMERKING: Paw zwakte wordt bepaald of een pup consequent valt van de draad met een poot voordat de andere plaats vrijgeven van de draad met beide poten tegelijkertijd. Herhaal test voor een totaal van drie keer. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figuur 5. Front-Limb Suspension. Deze schorsing testen zorgt ervoor dat de spanning in de voorpoten tot spiervermoeidheid. Met deze aanpak, basislijn sterkte in de voorpoten zijn gevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Suspension achterpoot (figuur 6): LET OP: Deze opschorting test bepaalt achterbeen kracht. Het is een test die speciaal voor pasgeborenen en werd aanvankelijk gebruikt op dieren tussen PND 2-12 19,20, maar kan worden aangepast voor muizen tot PND 14. Deze test kan rechter / linker achterpoot sterkte verschillen en neuromusculaire functie detecteren. Een standaard 50 ml conische wordt gebruikt, opgevuld met laboratorium doekjes. Net als bij de front-ledemaat ophanging test, kan deze test worden geleerd, vooral zondece is er geen negatief gevolg te vallen. Aldus verhoogde niet deelnemen, zoals gezien door muizen vallen zodra vrijgegeven of niet blijven wanneer zij aan de rand van de buis, kan worden opgemerkt. Met behulp van een 50 ml conische, plaats pup voorzichtig gezicht naar beneden in de buis met zijn achterste benen over de rand hangen. Laat de pup. Let op de achterbeen houding. Score houding volgens de volgende criteria. LET OP: Score van 4 geeft een normale achterbeen scheiding met staart verhoogd; score van 3 betekent zwakte is duidelijk en achterpoten zijn dichter bij elkaar, maar ze zelden elkaar raken; score van 2 geeft achterpoten liggen dicht bij elkaar en vaak ontroerend; score van 1 toont een zwak punt is duidelijk en de achterpoten zijn bijna altijd in een gevouwen positie met de staart opgeheven; een score van 0 duidt constant clasping van de achterpoten met de staart verlaagd of het niet te houden aan de buis voor een periode van tijd. Count trekt indien nodig. Een pull is kwaceerd wanneer de pup probeert zijn lichaam tillen met behulp van de achterpoten opgehangen, terwijl de kant van de conische buis. Met behulp van een timer of een stopwatch, registreren de latentie te vallen. Herhaal de gehele test in triplo. Figuur 6. Suspensie achterbeen. (A). Dit suspensiebeproeving veroorzaakt spanning in de achterpoten tot spiervermoeidheid. Baseline sterkte en houding in de achterpoten worden vastgesteld. (B). Scoring. Let op de nummers boven de vertegenwoordiger muizen aantonen van de mogelijke houding score. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Grip Strength (figuur 7): LET OP: Deze test zal de poot s onderzoekentrength van alle vier poten tegelijk. Een 16 x 18 glasvlies draad wordt gebruikt. De gemiddelde leeftijd van een knaagdier kunnen een horizontale scherm grijpen is PND 8 met een bereik van PND 5-15 15 Fox gebruikt de vier ledematen horizontale screeningtest van PND 2 -.. 21 10 Deze test is een modificatie van de standaard horizontale scherm test; hier het scherm wordt langzaam gedraaid vanuit een horizontale naar verticale positie, om de grijpen van alle vier de ledematen 21 dagen; aangepast van Corti S 16. Als de muis vasthoudt aan de maas scherm wanneer omgekeerd om 180 °, registreren de latentie te vallen. Let ook op het lichaamsgewicht. Een opknoping impuls kan worden berekend als [gewicht (g) x latentie dalen (sec)] die de kracht die nodig is om de zwaartekracht te weerstaan. Met behulp van een stukje gaas, plaatst u de pup op het scherm. Laat de pup aan te passen aan deze omgeving gedurende ongeveer 5 sec. Omkeren het scherm langzaam op 180 graden. Noteer de geschatte angle van het scherm wanneer de pup af valt. Herhaal dit voor een totaal van drie proeven en het gemiddelde van de proeven. Figuur 7. Grip Strength. Muizen worden verplicht om de spierspanning in alle vier de ledematen als zwaartekracht toeneemt ondersteunen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Grasping Reflex (figuur 8) LET OP: Het grijpen reflex verschijnt meestal in knaagdieren bij PND 7 met een bereik van PND 3-15 15 Elke poot wordt individueel getest, waardoor de test kan voor- of achterbeen kwesties, evenals eenzijdigheid problemen te onthullen.. Omdat het een reflex, kan deze test worden herhaald totdat de reflex verschijnt. Het is niet gevoelig voor het leren. Als een belangrijk voorbehoud, deze test maakt geen onderscheid grijpen kracht, alleen het vermogen, en dient vooraf te worden getest 15 dagen oud toen juveniele muizen beginnen te begrijpen als gevolg van respons vrezen. Houd de muis door het nekvel van de nek, ongeveer zoals een muis pup wordt gedragen door de dam. Deze greep zorgt ervoor dat de pup instinctief immobiel en ontspannen te worden, waardoor voor het gemak van het testen. Stroke elke poot van de pup met de stompe, afgeronde kant van een scheermesje. Test elke poot individueel en de aanwezigheid of afwezigheid van grijpen opnemen en score 1 punt per poot waarmee de muis grepen. LET OP: Het scoresysteem voor rechts poot voorkeur gaat 100% voor rechts poot voorkeur – – -100% voor de linkerpoot voorkeur, 50% voor beide poten vast te pakken, en 0% voor geen poten grijpen. De vergelijking van deze getallen te bepalen is [(rechter poot – linkerpoot) / (rechts poot + linkerpoot + beide poten)] x 100%. /53569/53569fig8.jpg "/> Figuur 8. Grasping Reflex. Omdat pasgeboren muizen niet beschikt over een sterke angstreactie hebben, deze test strikt bepaalt de plantaris / palmar reflex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Cliff Afkeer (Figuur 9): OPMERKING: Cliff afkeer proeven labyrint reflexen, en kracht en coördinatie en kan worden gebruikt om jongen te testen uit PND 1-14 22. Een pre-geurende doos (een doos waarin een minimum van 5 muizen werden toegestaan ​​om vrij rondlopen) met een vlakke verhoogde rand wordt gebruikt en de pup wordt geplaatst met de cijfers alleen van hun voorpoten en hun snuit gepositioneerd over de rand. Scoren wordt uitgevoerd door het tellen van de totale tijd die nodig is de pup weg van de afgrond te draaien en bewegen haar poten en snuit weg van de rand. Als er geen respons optreedt na 30 seconden, wordt de test beëindigd.Als de pup valt over de rand, kan een enkele bijkomende proef worden uitgevoerd. Met behulp van een zijaanzicht, plaatst u de pup aan de rand van de pre-geurende doos, om ervoor te zorgen dat de voorpoten, cijfers en snuit zijn de enige onderdelen over de rand. Laat pup en start timer. Nadat zowel de snuit en poten hebben van de rand verwijderd, stop de timer en een recordtijd. Herhaal test voor een totaal van 3 studies. Als de pup niet van klif beweegt binnen 30 sec, wordt er geen score gegeven. LET OP: De bepaling of de pup is een non-deelnemer versus afgewaardeerde wordt overgelaten aan het oordeel van de examinator. De hoogte van de klif kan worden aangepast aan de leeftijd van de pup om de veiligheid van het jong te verzekeren. Een kleinere hoogte kan worden gebruikt met een zwarte "vloer" naar een grotere hoogte emuleren. Figure 9. Cliff aversie. Vestibular onevenwichtigheden worden gemeten met behulp van de klif aversie-test. Hier worden de ogen van de pup nog steeds gesloten, zodat angst is niet de drijvende factor om te ontsnappen aan de rand van de klif te zetten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. statistische significantie Met behulp van een statistische software analyseert de resultaten. Express de gegevens als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Tests zijn parametrische en dus onderzoekt de gegevens met behulp van t-test analyses. LET OP: Experimenten werden niet ontworpen om te testen voor de verschillen tussen de geslachten. Verschillen worden als statistisch significant beschouwd bij p <0,05 is.

Representative Results

De muizen werden getest vanaf P7 (24 uur na de ingreep) naar P13 (1 week na de operatie), met behulp van verschillende muizen voor elk tijdstip-point, zodat het leren van een test paradigma was niet een verstorende variabele. P8 werd gekozen als representatieve resultaten, muizen toonde de grootste tekorten op dit tijdstip. Overgang van Crawling naar Walking wordt vertraagd CP pasgeboren muizen Human CP patiënten hebben gait afwijkingen, variërend van teen-walking een scissored gang. Omdat dit CP model displays Gait tekorten vergelijkbaar met de mens, werd het lopen beoordeeld. De muizen werden gescoord op gang symmetrie en ledematen-poot beweging tijdens een rechte wandeling. Op 48 uur na de ingreep (PND 8), CP muizen hadden minder symmetrische beweging van de ledematen en een "kruipende" gait in vergelijking met hun tegenhangers sham (gemiddelde ambulation score: CP 1.083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1,639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, figuur 10). Door één week, zowel CP en sham muizen overgestapt op wandelen (gegevens niet getoond). Figuur 10. CP Muis Pups niet zo goed ambulate als Shams. Sham muizen (zwarte balk) een gemiddelde score van 1,639 ± 0,4859 (n = 9), wat betekent dat hun ambulante ontwikkeling valt tussen asymmetrische beweging van de ledematen en langzaam kruipen. CP muizen (grijze balk) ontvangt een gemiddelde score van 1,083 ± 0,6337 (n = 12), wat betekent dat hun ambulation is minder ontwikkeld en hebben de neiging om asymmetrische beweging van de ledematen te hebben. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; * P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. hindlimb Foot Angle is verhoogd bij CP Naast ambulation werd achterbeen aan angle beoordeeld. Acht dagen oude sham muis pups lopen met hun achterpoten naar voren gericht, in vergelijking met HIL muizen, die hindpaws hebben gespreid bij het lopen in een rechte lijn (figuur 2, de gemiddelde hoek: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs sham 54,54 ± 8,043, n = 11; p <0,0001, figuur 11). Deze verhoogde hoek correleert met instabiliteit van de loop, dat de pups moet de hoek van de achterste poten om hun gang te stabiliseren en te helpen met balans en coördinatie verhogen. Figuur 11. CP Muis Pups Splay hun achterpoten bij het lopen. CP muizen (zwarte balken) hebben een gemiddelde hoek tussen de achterpoten van 77,48 ± 8,043 (n = 11), terwijl de sham muizen (grijs b ars) een gemiddelde hoek van 54,54 ± 9,848 (n = 9). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; **** P <0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. CP muizen niet vertonen tekorten bij Surface oprichtende Het oppervlak oprichtende test werd opgenomen omdat sommige CP patiënten kofferbak controle hebben Slechtzienden (Heyrman et al., 2013). Bovendien, het vestibulaire systeem is noodzakelijk om de noodzaak oprichtende detecteren en er vestibulaire stoornissen bij sommige patiënten CP 23. CP muizen geen significante gebreken vertonen bij het oprichten vergelijking met schijncontroles (gegevens niet getoond). CP Muizen Voer de Zelfde als Sham in Negative geotaxis Testing t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Negatieve geotaxis wordt gebruikt om motorische coördinatie te testen bij jonge pups Muizen worden uitgedaagd door zijn plaats geconfronteerd afdaling op een hellend vlak Vertraging of het niet te oriënteren bergop tekorten kunnen wijzen.. in coördinatie, evenwicht, of vestibulaire ingang. CP muizen vertonen geen gebreken bij provocatie met negatieve geotaxis vergeleken met sham muizen (gegevens niet getoond). Verder CP muizen geen voorkeur laten zien keren tot een zijde tegenover elkaar wanneer heroriëntering . Front-Limb Suspension proef is geschikt voor muizen ouder dan 10 dagen CP patiënten hebben spierspanning en tekorten daalde in de fijne motoriek, zoals grijpen. Zwakte in deze muis model te testen, gebruikten we een front-ledemaat suspensiebeproeving. Bovendien is dit model maakt gebruik van eenzijdige ischemische letsel en sided-ness kan worden bepaald met behulp van deze opschorting te testen. Deze testis beter voor muizen ouder dan 10 dagen 15. 8 dagen oud, twee dagen na verwonding, waren er geen significante verschillen tussen CP en sham muizen (gegevens niet getoond). Achterbeen Strength is verminderd bij CP Muizen CP menselijke patiënten hebben vaak beugels of ondersteunende inrichtingen lopen door gebrek aan motorische controle en sterkte. Om de CP knaagdier model voor de mens te vergelijken, werd achterbeen sterkte berekend volgens de achterpoot suspensietest. Wanneer opgehangen aan de kant van een conische buis, CP muizen bleek achterbeen zwakte, zoals aangetoond door een afname van de opknoping score (achterbeen opknoping score: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, figuur 12). Geen verschil werd waargenomen in achterpoot suspensie tijd (gegevens niet getoond). Aldus lijkt op humane patiënten CP CP muizen tonen hindlIMB (been) zwakte. Figuur 12. Sham Muizen zijn Enigszins maar significant sterker in hun achterpoten dan CP Mice. Bij een gemiddelde hangen score van 3,891 ± 0,1329 (n = 13), sham muizen (zwarte balk) toon meer hindlimb scheiding, en dus een sterkere achterbeen houding, wanneer opknoping aan de rand van een buis dan CP muizen (grijze balk) met een gemiddelde hangende score van 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; * P <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Grip Strength is een daling als gevolg CP Injury Grijpen met vier poten is belangrijk voor een knaagdiertermen van klimmen en lopen over oneffen oppervlakken. Grip vereist aanzienlijke aanhoudende sterkte, in plaats van handigheid of lineaire kracht, vooral in de cijfers en poten 24. Muizen moesten hun lichaamsgewicht aanhouden omgekeerde draadrooster. CP muizen waren niet in staat hun greep houden en deze muizen viel tegen aanzienlijk lagere hoeken (vier ledematen gemiddelde hoek: CP 75,627 ± 24.48, n = 11, vs sham 96,57 ± 10,836, n = 9; p <0,05, Figuur 13). Deze gegevens tonen aan dat er een aanzienlijk tekort in grijpkracht CP muizen. Figuur 13. CP Muizen hebben Zwakker Grip dan Shams. Sham muizen (zwarte balk) kan vatten tot een gemiddelde omgekeerde hoek van 96,57 ± 10,836 (n = 9). CP muizen (grijze balk) kan alleen een omgekeerde hoek van 75,627 ± 24,48 (n = 11) te bereiken. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; * P0; 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Grasping Reflex Tekorten zijn duidelijk zichtbaar in CP Muizen Samen met een tekort op de grove motoriek, zijn fijne motorische bewegingen ook een verminderde in CP patiënten 25,26. De grijpreflex mens aanwezig is bij de geboorte en verdwijnt ongeveer 5-6 maanden. Veranderingen in de grijpreflex, zoals overdreven snelheid of kracht grijpen, niet grijpen of de nieuwe trend van de grijpreflex na 6 maanden, alle wijzen beschadiging van het zenuwstelsel. Ter vergelijking grijpen in de CP model, werden de tekorten reflexieve grijpen bepaald. Op 48 uur na een blessure, CP muizen tonen een daling van grijpreflex (gemiddeld poten gegrepenna 48 uur: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs sham 3,214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, figuur 14A). Er was een lichte maar niet significante toename rechterpoot voorkeur in de voorpoten (gegevens niet getoond). Er was een significant rechterpoot voorkeur in de achterpoten (CP 75,0 ± 42,74, n = 14, vs sham 17,86 ± 54,09, n = 14; p <0,005, figuur 14B). Een week na een blessure, CP muizen tonen grijpen tekorten (gemiddeld poten gegrepen op 1 week: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0,05, figuur 14C), zonder noemenswaardige poot voorkeur . Figuur 14. CP Muizen hebben Grasping tekorten, in de achterpoten, contralaterale de Gewonde Brain Gewest. (A) 48 uur na letsel (PND 8), CP muizen (grijze balk) te grijpen een stok met gemiddeld minder poten dan sham animals (zwarte balk). (B) CP muizen (grijze balk) vertonen een voorkeur voor het grijpen met de rechter achterpoot (contralateraal van schade), in tegenstelling tot met de linker achterpoot (ipsilaterale schade). Sham muizen (zwarte balk) niet dit recht poot voorkeur te geven. Rechter poot voorkeur wordt berekend als ([right paw – linkerpoot] / [right paw + linkerpoot + beide poten] * 100) (C) Een week na verwonding, CP muizen (grijze balk) nog steeds grijpen tekorten laten zien ten opzichte van. shams (zwarte balk). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; * P <0,05, ** p <0,005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. CP Muizen afkeren van de Edge Tijdens Cliff aversie De klif afkeer-test is gebaseerd op de inherente angst van de muizen te draaien away van een steile klif en ga richting veiligheid. Hoewel sommige CP patiënten vestibulaire problemen, evenals verminderde motorische controle, heeft de CP muizen geen verliezen op deze test tonen.

Discussion

Met behulp van diermodellen om menselijke ziekten te studeren is alleen relevant als er overlap tussen de moleculaire en cellulaire respons tussen mens en knaagdieren en dat de gedrags-tests hebben directe relevantie voor de menselijke symptomen. Een van de belangrijkste problemen met kinderstudies ziekte is dat veel onderzoekers gebruiken volwassen knaagdieren het model en volwassen knaagdieren gedragsevaluatie maken, zonder de ontwikkeling verschillen die belangrijk zijn voor het ziekteproces zijn. Omwille van deze problemen is het van belang dat het onderzoek naar pediatrisch gebruik ziekte niet alleen de juiste ingestelde ontwikkeling tijdstippen (bijvoorbeeld humane CNS ontwikkeling op 28-32 weken komt overeen met een postnatale dag 2-7 dagen knaagdier) 7, maar ook gedrags-tests die de juiste motor, zintuiglijke of reflexieve ontwikkelingsstoornissen gedrag te onderzoeken. Dus als elk nieuw neonatale ziektemodel ontwikkeld, moet worden getest om te verzekeren dat de cellulaireen gedragsreacties zal de meest geschikte vertaalbaar gegevens tussen knaagdieren en mensen te voorzien.

Cerebrale parese is een motorische stoornis, die blijven bestaan ​​in de volwassenheid. Een probleem met veel van de cerebrale parese modellen vandaag is het gebrek aan herhaalbare, standaardmotor test die kan correleren met de tekorten waargenomen bij pediatrische patiënten. In dit nieuwe model, dat hypoxie, ischemie en ontsteking combineert in een neonatale muis werd motorisch gedrag geëvalueerd met een serie testen specifiek voor neonatale muizen. Om de subjectiviteit verminderen en daarmee de kwantitatieve rapportage, zijn verschillende testen gewijzigd zeer specifiek, maar eenvoudig maatregelen die kunnen worden gestandaardiseerd evalueren omvatten. Bovendien kunnen voor- en achterbeen evaluaties apart worden uitgevoerd, en links / rechts verschillen kan worden bepaald. Deze serie testen is specifiek voor neonatale muizen tot twee weken.

Deze CP model toontmoeite met lopen (ambulant, achterbeen voet hoek), maar ook de ledematen-specifieke zwakte (vier ledematen schorsing, achterbeen schorsing) en tekorten in ontwikkelings reflexen (grijpen reflex). Hoewel in deze studie één tijdstip werd onderzocht, kan deze tekorten worden gevolgd in de tijd.

Er zijn andere batterijen tests die kunnen worden gebruikt op het kind, zoals batterijen Fox's of tests of Heyser's Beoordeling ontwikkelingsmijlpalen 15. Echter, deze tests vergelijken de foetus tot de volwassen, waarvan de antwoorden niet dezelfde omdat de pasgeborene is nog in ontwikkeling. Fox's batterij en Heyser's assement testen vertrouwen op observationele subjectieve informatie met dichotome (ja of nee) relatie, in plaats van objectieve gegevens (hoek, houding op basis van sterkte, etc). Vanwege de subjectiviteit van deze proeven zijn vele wetenschappers aangepast, toegevoegd of verwijderd criteria, waardoor de resultaten niet te vergelijken met anderen en beperkening de bruikbaarheid van de gegevens in termen van bepalen van een basaal tekort voor een bepaalde ziekte of aandoening. Door de oprichting van een set van gestandaardiseerde motorische tests die kwalitatieve en speciaal ontworpen om pasgeborenen te testen zijn, kunnen de resultaten van individuele onderzoeksgroepen nauwkeurig en betrouwbaar worden gerapporteerd en vergeleken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank everyone at Shriners Hospital Pediatric Research Center, in particular Dr. Mickey Seltzer, of whom without his support, this work would not have been funded. In addition, we would like to thank Isha Srivastava, who contributed to early data collection and Amy He, who helped with the figures. This study was funded by Shriners Hospitals for Children. No funding source played a role in experimental design or decision to submit the paper for publication.

Materials

C57BL/6 mice Charles River Laboratories STRAIN CODE: 027  C57BL/6NCrl is the exact strain we use
Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish Corning Life Sciences Glass  3140125 Capacity: 25.03 oz. (740mL); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399).
Covered lead ring Fisher Scientific S90139C Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish.
Scalpel Blade #11 World Precision Instrucments, Inc. 500240
Small Vessel Cauterizer Fine Science Tools 18000-00
Micro Hook Fine Science Tools 10064-14
Vetbond Suture Glue 3M 1469SB n-butyl cyanoacrylate adhesive
Lipopolysaccharide Sigma Life Science L4391 Lipopolysaccaride from e.coli 0111:B4, gamma irradiated
12×12 inch opaque box Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics C4022 Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H;  http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html
Camera/camcorder JVC GC-PX100BUS Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder.
Covidien Tendersorb™ Underpads Kendall Healthcare Products Co 7174
WypAll L40 Kimberly-Clark Professional 5600 Any surface with moderate grip will do
Surface at 45 degree incline We use a cardboard box.
Thin wire from a pipe cleaner Creatology M10314420 Any pipe cleaner from any craft store will work.
50mL conical tube Falcon 352070
Fiberglass Screen Wire New York Wire  www.lowes.com 14436 Any supplier can be used as long as their screen is 16×16 or 18×16
Razor blade Fisherbrand 12-640 A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work.
OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway PLASKOLITE INC 1AG2196A Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2"x2"; (3) 2"x 18"; (1) 2"x15.5"; (1) 2"x3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning.
Protractor Westscott ACM14371
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
  2. Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
  3. Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  4. Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
  5. Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
  6. Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
  7. Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
  8. Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
  9. Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
  10. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  11. Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
  12. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
  13. Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, . Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
  14. Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
  15. Heyser, C. J., Crawley, J. Q., et al. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Chapter 8, (2004).
  16. Corti, S. . Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , (2014).
  17. Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
  18. Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
  19. El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
  20. El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), 29-43 (2008).
  21. Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
  22. Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , (2008).
  23. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. , (2016).
  24. Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
  25. Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
  26. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).

Tags

Neonatal Motor TestsCerebral PalsyMouse ModelAmbulationCrawlingHindlimb PostureFoot AngleRighting ReflexQuantifiable Scoring SystemMotor DeficitsInjury ModelDisease ModelTreatment Validation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feather-Schussler, D. N., Ferguson, T. S. A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy. J. Vis. Exp. (117), e53569, doi:10.3791/53569 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image