Eine Batterie von Motortests in einer Neugeborenen-Maus-Modell der Zerebralparese

HINWEIS: Alle Tier Operationen wurden in Übereinstimmung mit Temple University ULAR Abteilung und IACUC Richtlinien und Verfahren durchgeführt werden. C57BL / 6 Dämme und Vererber wurden von Charles River Laboratories erworben und wurden in Zuchtkäfigen mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus (Licht an 7.00 bis 19.00 Uhr) untergebracht mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Brutpaare erzeugt Wurfgrößen zwischen 5-10 Welpen. 1. Cerebralparese Induktions-Chirurgie HINWEIS: Zerebralparese wurde mit postnatalen Tag (PND) 6 Maus Welpen induziert wird , wie zuvor beschrieben , 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia). Legen Sie ein Welpe in einer Glasschale auf Eis mit einem Labor wischen den Welpen der Haut zu schützen. Prüfen Sie, ob geeignete Anästhetikum Ebene zu Fuß Prise und Mangel an Bewegung. Bewegen Sie den Welpen zu einem gepolsterten Eisbeutel für die Chirurgie. Sterilisieren Sie die Haut von den Welpen unter Verwendung von 70% igem Ethanol. Wenn es trocken ist, verwenden Sie ein # 11 sterile OP-blade und machen ein 1 cm langer Schnitt in den Hals. mit einem tragbaren Hand Ausbrenner unter Verwendung eines stereoskopischen Operationsmikroskop, isolieren die rechte Arteria carotis communis mit einem kleinen Haken und ausbrennen. Optisch bestätigen, dass die Arterie verschlossen wird. Sham Chirurgie umfasst Visualisierung und Isolierung der Arteria carotis communis ohne Kauterisation. Richten Sie die Haut und in der Nähe mit Nahtkleber (n-Butyl-Cyanacrylat). Platzieren Sie den Welpen auf einem 34 o C Heizkissen für 30 min für die Spontanatmung und die normale Bewegung zu überwachen. Bringen Sie den Welpen (e) für 30 min zu stauen. Legen Sie die Welpen auf einem Heizkissen oder einer anderen Wärmegerät bei 34 ° C in einer Hypoxie Kammer eingestellt auf 6% Sauerstoff für 35 min eingestellt. Sauerstoff wird durch Stickstoff ersetzt. die Kammer Sauerstoffgehalt und Temperatur für eine konsistente Verletzungen Ergebnisse genau zu überwachen. Entfernen Sie die Welpen aus der Hypoxie Kammer und bringt sie zu dem Heizkissen. Intraperitoneal injizieren LipopolySaccharid bei 1 & mgr; g / kg in steriler Kochsalzlösung verdünnt und den Welpen auf den Damm zurück. nur Scheininjektionen sind Injektionen von Kochsalzlösung. 2. Neonatal Motortests HINWEIS: Bei PND 8, 48 Stunden nach der CP Induktion, Maus Welpen für Neuropsychologische Entwicklung getestet werden. Pups sind innerhalb von 4 Stunden Block vor Mittag, um Tageszeit Unterschiede im Verhalten zu beseitigen getestet. Pups aus dem Damm für nicht mehr als 15 Minuten zu einer Zeit entfernt zu einem schnellen Verlust von Körperwärme und Hunger / Trennung Probleme zu vermeiden. Zusätzlich werden Welpen so ruhen in zwischen den Tests erlaubt, dass die maximale Anstrengungen werden auf jedem Test ausgelöst werden. Die Grundlage der neonatalen motorischen Tests wird Fox Batterie von Tests angepasst mit 10,11 und Wahlsten die Anpassung von Fox Tests 12 sowie Treat-NMD und andere Verhalten Publikationen (wie im Text für jeden Test angegeben). Fox Batterie von Tests sind geeignet für PND 2 – 21. Von Fox-Tests, der Teigy vorhanden hier beinhaltet: Reflex aufrichtenden, Greifen Reflex, negativ geotaxis und vier Gliedmaßen Griffstärke (modifiziert von Fox und Wahlsten Bildschirm Kletterversuche) (vertikale Screen-Test in Fox Batterie genannt). Hier Gehfähigkeit, Vorderschenkel-Stärke und hinteren Gliedmaßen Stärke auch zu unterscheiden reflexive motorisches Verhalten zwischen Schein und CP Maus Welpen getestet. Um Verbesserungen auf Tests beseitigen aufgrund Lernen wurden Tests auf maximal drei Versuche beschränkt, in denen festgestellt. Alle anderen Prüfungen hatte nur einen Versuch pro Tier. Gehfähigkeit (Abbildung 1) (angepasst aus einem Ratten Protokoll 13): HINWEIS: Crawling ist ein Verhalten , früh in der Maus pup zwischen PND entwickelt 0 – 5 aus , an welchem Punkt Mäuse beginnen , von 5 bis Fuß, für den Übergang – 10 Tagen alt 14. Bei PND 8 nimmt der Gehfähigkeit Test Vorteil dieses Übergangszeitverlauf. Ambulation kann jedoch während der gesamten Lebensdauer einer Maus erzielt und kann in jedem Alter bestimmt werden.Da es kein Potential für das Lernen ist, kann die Gehfähigkeit Test so oft wiederholt werden, wie durch den Verlauf des Versuchs benötigt. Platz Mäuse in einer klaren Gehäuse wo Mäuse von oben sichtbar sind, als auch der Seite. Verwenden Sie sanfte Stups der kleine Hund in den Schwanz zu berühren den Welpen zu motivieren, zu gehen. Ergebnis Gehfähigkeit für 3 min mit der folgenden Skala: 0 = keine Bewegung, 1 = kriechend mit asymmetrischen Bewegung des Körpers, 2 = langsam kriechenden aber symmetrische Bewegung des Körpers und 3 = schnell kriechende / Walking. HINWEIS: Hier symmetrische Gliedbewegung beschrieben wird, wo hindpaws frontpaws bei jedem Schritt zu erfüllen, und jeder Schritt reibungslos Übergänge zu dem nächsten Schritt. Eine Maus Anzeige asymmetrische Bewegung des Körpers hat unberechenbar Pfote Platzierung und Übergänge von einem Schritt zum nächsten sind nicht glatt. Abbildung 1. Der Übergang vonKriechen zu Walking kann durch die Beobachtung der Hinterpfote, sowie den Kopf und Schwanz. (A) Während Krabbeln, die gesamte Hinterpfote, von den Zehen bis zur Ferse, den Boden berührt zu unterscheiden , wenn ambulating, wie bezeichnet mit (*). Ein Erwachsener Gangmuster ist zu sehen , wenn nur die Zehen und vorderen Teil des den Boden berühren Hinterpfote (der Ferse erhöht ist, deonoted von [**]). (B) der Kopf und Schwanz eines kriechenden Maus ist niedrig zu Boden. Der Kopf beginnt vom Kriechen zum Gehen während des Übergangs zu steigen. Der Übergang ist abgeschlossen , wenn sowohl der Kopf und Schwanz erhöht sind und nur die Vorderseite der Hinterpfote den Boden berührt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Hindlimb Fußwinkel (Abbildung 2) HINWEIS: Es gibt eine scheinbare Entwicklungs Veränderung in der hinteren Gliedmaßen Haltung als mouse reift zu Fuß vom Kriechen, wo die hinteren Gliedmaßen unter dem Körper positioniert sind, wenn man zu Fuß und der Winkel zwischen der hinteren Gliedmaßen kleiner ist als der Winkel gesehen in kriecht. Auch wenn der hindlimb Fußwinkel im Laufe der Zeit ändert, Maus Welpen im gleichen Alter mit unterschiedlichen Verletzungen oder Krankheiten können verglichen werden. Ähnlich dem ambulation Test (3,1), gibt es kein Potential für das Lernen. Somit kann der hindlimb Fußwinkel Test so oft wiederholt werden, wie durch den Verlauf des Versuchs benötigt. Entweder in einem klaren offenen Feld-Box oder einem geschlossenen Bereich, montieren Sie eine Videokamera von oben oder unten, bzw. den Welpen aufnehmen, wie es um das Feld bewegt. Verwenden Sie sanfte Stups der kleine Hund in den Schwanz zu berühren den Welpen zu motivieren, zu gehen. Nehmen Sie für zwei Minuten. Mit Hilfe der Videoaufnahmen, messen Sie den Fußwinkel der Welpen durch eine Linie vom Ende der Ferse / shin an der Spitze des längsten (Mitte) toe Zeichnung. Nur die Messung nehmen, wenn der Welpe einen vollen Schritt ausführtin einer geraden Linie und sind beide Füße flach auf dem Boden. Nehmen Sie keine Messungen während der Welpe stationär ist oder während der Welpe dreht. Messen Sie drei vor fünf Sätze von Fuß Winkel und berechnen den mittleren Winkel für jeden getesteten Welpen. Abbildung 2. hindlimb Fußwinkel kann zur Bestimmung Gait Abnormalitäten verwendet werden. Der Fußwinkel kann durch Ziehen einer Linie von der Mitte der Ferse durch die Mitte (längste) Ziffer gemessen werden. Verletzte Tiere einen größeren Fußwinkel haben , wenn in den normalen verglichen (siehe Repräsentative Ergebnisse, Fußwinkel). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Aufrichtungs- (Abbildung 3): HINWEIS: Die aufrichtenden Reflex ist der Motor Fähigkeit eine Maus pup auf die Füße von einer Rückenlage zu kippen zu können. Das Durchschnittsalter für das Stellreflexes in Nagetieren erscheinen soll PND 5 mit einem Bereich von PND . 1 – 10 15 Da dieser Test ein Reflex ist, gibt es keine Lernkomponente , und es kann in der gesamten Experimente Periode wiederholt werden. Legen Sie Welpen auf dem Rücken auf einem Baumwolltuch oder Bank-Pad und halten in Position für 5 Sekunden. Lassen Sie die Jungen und notieren Sie die Zeit, die der Welpe nimmt zu Bauchlage zurückzukehren, sowie die Richtung der aufrichtenden (links oder rechts). Insgesamt eine min wird für jeden Versuch angegeben, falls erforderlich. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Versuche. Abbildung 3. Aufrichtungs-. Dieser Test erfordert die Kontrolle Stamm und kann für Haltungs- Ungleichgewichte testen. Menschliche CP-Patienten haben Defizite in ihrem Kern.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Negative Geotaxis (Figur 4) HINWEIS: Das Durchschnittsalter für negative geotaxis Reflex bei Nagetieren zu erscheinen ist PND 7 mit einem Bereich von PND 3-15 15 Die negative geotaxis Test bewertet die motorische Koordination bei jungen Mäusen.. Die Mäuse werden platziert nach unten eine Steigung und aufgrund vestibulären Signale der Schwerkraft, Welpen die Neigung zu stellen drehen. Die Reaktion auf einen Reiz oder Taxis, ist eine angeborene Verhalten. Platzieren Sie den Welpen mit dem Kopf nach unten gerichtet auf einem 45 o Neigung und halten Sie ihn für 5 Sekunden. Lassen Sie den Welpen und notieren Sie die Zeit und die Richtung der Welpe nach oben zu Gesicht dreht. Gesamttestzeit beträgt 2 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Versuche. Mäuse, die auf der Steigung fallen oder ausfallen können zu drehen sein entweder wieder getestet, beseitigt oder eine Null-Bewertung gegeben. HINWEIS: Diese Entscheidung ist links an den Prüfer, wie gelegentlich Welpen rollen die Steigung aufgrund Schläfrigkeit eher als Schwäche nach unten. Sobald die Entscheidung über gemacht wird, wie Welpen zu punkten, die die Neigung nach unten fallen, sollte es in den Verfahren zu beachten, und sollte während der gesamten Prüfung aller Themen im Einklang stehen. Abbildung 4. Negative Geotaxis. Motor und vestibulären Eingang ist für die Maus benötigt , um ihre Orientierung an einem Hang zu erkennen und sich zu drehen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Vorderschenkel – Suspension (Abbildung 5) 16; angepasst von 17, 18: HINWEIS: Front Gliedmaßen Suspension testet die forelimb Stärke von Welpen, einschließlich Arm und Pfote Stärke. Tseine Test ist für Welpen jünger als PND 10 15 nicht zu empfehlen. Pups dürfen einen Draht über einen stabilen Gegenstand aufgereiht zu erfassen und mit beiden Vorderpfoten auf den Draht hängen. Der Testbereich ist über einen gepolsterten Drop-Zone. Der Test kann rechts / links Stärkeunterschiede erkennen. Lernen und das Fehlen von negativen Verstärkung kann zu erhöhten Nicht-Teilnahme führen. Mäuse sofort fallen, wenn sie losgelassen oder Fehler zu erfassen, wenn sie auf dem Draht angeordnet sind bezeichnend für die Nichtbeteiligung. Halten Sie die Welpen fest durch den Körper und es ihnen ermöglichen, den Draht mit beiden Vorderpfoten zu erreichen. Lassen Sie den Welpen. Mit einem Timer oder Stoppuhr, notieren Sie die Gesamtzeit, sowie Pfote Schwäche zu fallen. HINWEIS: Paw Schwäche bestimmt wird, ob ein Welpe konsequent aus dem Draht vor dem anderen mit einer Pfote fällt, anstatt mit beiden Pfoten zugleich von dem Draht freigesetzt wird. Wiederholen Sie den Test für insgesamt drei Mal. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Abbildung 5. Front Gliedmaßen Suspension. Diese Suspension Test führt zu Spannungen in den vorderen Gliedmaßen bis Muskelermüdung. Mit diesem Ansatz werden Basisstärke in den vorderen Gliedmaßen etabliert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Hindlimb Suspension (Abbildung 6): HINWEIS: Diese Suspension Test hindlimb Stärke bestimmt. Es ist ein Test speziell für Neugeborene entwickelt und wurde zunächst an Tieren verwendet , um zwischen PND 2 – 12 19,20, kann aber für Mäuse bis PND 14. Dieser Test angepasst werden kann , rechts / links hindlimb Stärkeunterschiede sowie neuromuskuläre Funktion erkennen. Ein Standard-50-ml-Erlen wird, aufgefüllt mit Labortücher verwendet. Ähnlich wie die Front-Glied Suspensionstest Dieser Test kann gelernt werden, vor allem since gibt es keine negative Folge zu fallen. Somit erhöhte Nichtbeteiligung, wie von Mäusen beobachtet, sobald fallen, wie er freigegeben oder Mißerfolg zu bleiben, wenn sie auf den Rand des Rohres angeordnet ist, festgestellt werden kann. Mit einem 50 ml konischen Ort pup sanft Gesicht in das Rohr nach unten mit den Hinterbeinen über den Rand gehängt. Lassen Sie den Welpen. Beachten Sie die hinteren Gliedmaßen Haltung. Score Haltung nach den folgenden Kriterien bewertet. HINWEIS: Score von 4 zeigt normale hindlimb Trennung mit Schwanz angehoben; Score von 3 bedeutet Schwäche ist offensichtlich und hinteren Gliedmaßen sind näher zusammen, aber sie berühren selten einander; Score von 2 zeigt hindlimbs sind nahe beieinander und oft rührend; Score von 1 zeigt eine Schwäche ist offensichtlich, und die hinteren Gliedmaßen sind fast immer in einer gefalteten Position mit dem Schwanz angehoben; eine Punktzahl von 0 zeigt konstant Umklammerung der hinteren Gliedmaßen mit dem Schwanz gesenkt oder Versagen auf das Rohr für einen beliebigen Zeitraum zu halten. Graf zieht, wenn nötig. Ein Pull ist qualified wenn der Pup seinen Körper mit seiner hinteren Gliedmaßen, während auf der Seite des konischen Rohrs aufgehängt zu heben versucht. Mit einem Timer oder Stoppuhr, notieren Sie die Latenzzeit zu fallen. Wiederholen Sie den gesamten Test in dreifacher Ausfertigung. Abbildung 6. hindlimb Suspension. (A). Diese Suspension Test führt zu Spannungen in den hinteren Gliedmaßen, bis der Muskelermüdung. Baseline Stärke und Haltung in den hinteren Gliedmaßen festgelegt. (B). Scoring. Notieren Sie sich die Zahlen über den repräsentativen Mäusen die mögliche Haltung Punktzahl demonstriert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Griffstärke (Abbildung 7): HINWEIS: Bei diesem Test wird die Pfote s prüfentrength aller vier Pfoten zugleich. Ein 16 x 18 Glasfaser-Bildschirm Draht verwendet wird. Das Durchschnittsalter für ein Nagetier einen horizontalen Bildschirm zu erfassen zu können ist PND 8 mit einem Bereich von PND 5 bis 15 15 Fox den vier Gliedmaßen horizontalen Bildschirm Test von PND 2 verwendet -.. 21 10 Dieser Test aus dem Standard horizontal geändert wird Bildschirmtest; hier wird der Bildschirm langsam von einer horizontalen in die vertikale Position gedreht wird , 21 das Ergreifen aller vier Gliedmaßen herausfordern; von Corti S angepasst 16. Wenn die Maus auf das Siebnetz hält an, wenn auf 180 ° invertiert aufzeichnen die Latenz zu fallen. Beachten Sie auch, um das Körpergewicht. Eine hängende Impuls kann berechnet werden, um die Kraft [Gewicht (g) x Latenz zu fallen (s)] reflektieren benötigt Schwerkraft zu widerstehen. Mit einem Stück Maschendraht, legen Sie den Welpen auf dem Bildschirm. Lassen Sie den Welpen für ca. 5 Sekunden an diese Umgebung anzupassen. Kehren Sie den Bildschirm langsam auf 180 Grad. Notieren Sie sich die ungefähre angle des Bildschirms, wenn der Welpe abfällt. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Versuche und der Mittelwert der Studien. Abbildung 7. Griffstärke. Die Mäuse sind erforderlich , um die Muskelspannung in allen vier Gliedmaßen als Gravitationskraft erhöht sich aufrecht zu erhalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Grasping Reflex (Abbildung 8) HINWEIS: Der Greifreflex erscheint in der Regel bei Nagern bei PND 7 mit einem Bereich von PND 3-15 15 Jede Pfote einzeln geprüft wird, so kann der Test front- oder hindlimb Fragen sowie Einseitigkeit Probleme offenbaren.. Da es ein Reflex ist, kann dieser Test wiederholt werden, bis der Reflex erscheint. Es ist nicht anfällig für das Lernen. Als wichtige Einschränkung dieser Test unterscheidet nicht Greifkraft, nur Fähigkeit und muss vor dem Alter von 15 Tagen getestet werden, wenn jugendliche Mäuse beginnen aufgrund erfassen Reaktion zu befürchten. Halten Sie die Maus durch das Genick seines Halses, ähnlich wie eine Maus pup durch den Damm getragen wird. Dieser Halt bewirkt, dass der Welpe instinktiv unbeweglich und entspannt zu werden, so dass für einfache Tests. Stroke jede Pfote des Welpen mit dem stumpfen, abgerundeten Seite einer Rasierklinge. Testen Sie jede Pfote einzeln und das Vorhandensein oder Fehlen des Greifens aufnehmen und 1 Punkt pro Pfote punkten, mit dem die Maus greift. HINWEIS: Die Bewertung für die rechte Pfote Präferenz ist zu 100% für die rechte Pfote bevorzugt – – -100% für die linke Pfote Präferenz, 50% für beide Pfoten greifen und 0% für keine Pfoten greifen. Die Gleichung, diese Zahlen zu ermitteln ist [(rechte Pfote – linke Pfote) / (rechte Pfote + linke Pfote + beide Pfoten)] x 100%. /53569/53569fig8.jpg "/> Abbildung 8. Grasping Reflex. Da neugeborenen Mäusen keine starke Angstreaktion haben, dieser Test bestimmt streng die plantare / palmar Reflex. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Cliff Aversion (Abbildung 9): HINWEIS: Cliff Aversion Tests Reflexe Labyrinth, sowie Kraft und Koordination und kann verwendet werden Welpen von PND 1-14 22 zu testen. Ein Pre-Duftkasten (ein Feld, in dem mindestens 5 Mäuse erlaubt wurden frei bewegen) mit einem flachen erhöhten Vorsprung verwendet wird, und der Welpe wird mit den Ziffern platziert nur ihre Vorderpfoten und ihre Schnauze über den Rand positioniert. Scoring wird durch Zählen der Gesamtzeit führte sie den Welpen nimmt von der Klippe abwenden und seine Pfoten und Schnauze weg von der Kante. Wenn keine Antwort nach 30 sec zu sehen ist, wird der Test abgebrochen.Wenn der Welpe den Rand fällt, kann eine einzige zusätzliche Studie durchgeführt werden. Mit Hilfe einer Seitenansicht, legen Sie den Welpen am Rande des vorge duftend Box, um sicherzustellen, dass die Vorderpfoten, Ziffern und Schnauze die einzigen Teile, über den Rand sind. Lassen Sie Welpe und starten Timer. Nachdem sowohl die Schnauze und Pfoten von der Kante entfernt wurden, um den Timer und Rekordzeit beenden. Wiederholen Sie den Test für insgesamt 3 Versuche. Wenn der Welpe von Klippe innerhalb von 30 Sekunden nicht weg bewegen, wird keine Punktzahl gegeben. HINWEIS: Die Bestimmung, ob der Welpe ist ein nicht-participator im Vergleich zu dem Ermessen des Prüfers überlassen beeinträchtigt wird. Die Höhe der Klippe kann für das Alter des Welpen angepasst werden, um die Welpen die Sicherheit zu gewährleisten. Eine kleinere Höhe kann mit einem schwarzen "Boden" verwendet werden, um eine größere Höhe zu emulieren. figure 9. Cliff Aversion. Vestibular Ungleichgewichte gemessen , um die Klippe Aversion Test. Hier werden die Welpen die Augen noch geschlossen , so Angst ist nicht der treibende Faktor abwenden vom Rand der Klippe. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. statistische Signifikanz eine Statistik-Software Mit Hilfe der Ergebnisse analysieren. Express die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Tests sind parametrisch und somit prüfen, die Daten unter Verwendung von t-Test analysiert. HINWEIS: Die Experimente wurden nicht für geschlechtsspezifische Unterschiede zu testen konzipiert. Unterschiede werden als statistisch signifikant, wenn p <0,05 sein.