JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Une batterie de tests de moteur dans un modèle de souris néonatale de paralysie cérébrale

Published: November 03, 2016
doi:
10.3791/53569
,
1Department of Medical Genetics and Molecular Biochemistry,Lewiz Katz School of Medicine at Temple University, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center

Summary

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Abstract

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Introduction

Le développement de nouveaux modèles de blessures chez les enfants ou les maladies en utilisant des rongeurs est souvent difficile en raison de l'incroyable capacité des rats et des souris pour récupérer rapidement des lésions neurologiques. Par conséquent, afin de valider tout nouveau modèle de maladie pédiatrique, en examinant soigneusement les changements cellulaires et moléculaires doit aller de pair avec les résultats comportementaux. À bien des égards, la récupération fonctionnelle du comportement peut être plus important que les changements cellulaires sous-jacents en termes de pertinence thérapeutique ou translationnelle. En tant que chercheurs en apprendre davantage sur les blessures chez l'adulte et le nouveau-né, il est clair que leurs réponses sont très différentes et ne peuvent pas être extrapolés entre les deux. Par exemple, les souris néonatales affichent différents niveaux de facteur de croissance des nerfs, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau, la neurotrophine-3 et le facteur neurotrophique lignée cellulaire dérivée gliale après une lésion de la moelle épinière 1,2. De plus, les nouveau – nés ont une fuite importante barrière hémato-encéphalique après un AVC 3, demonstrate corticale neurone réarrangement après lésion du nerf périphérique 4, et ont une astrogliosis retardée ou ralentie suite à une lésion de la moelle épinière et de l' hypoxie-ischémie 5,6. Par conséquent, il est important que la recherche pédiatrique translationnelle utilisent des modèles de développement équivalents et que ces modèles sont évalués pour les changements moléculaires / cellulaires et des tests de comportement appropriés à l' âge.

Infirmité motrice cérébrale (CP) est un trouble moteur qui affecte 3: 1000 naissances vivantes par an (NIH). Les enfants atteints de CP présentent un éventail de symptômes et les conditions co-morbides, en fonction de la gravité de la maladie. Difficulté avec le mouvement et la coordination sont des signes les plus courants, ainsi que des retards dans l'atteinte de jalons de développement du moteur. D'autres signes comprennent le tonus musculaire anormal (soit augmenté ou diminué), réduit la motricité fine, la difficulté à marcher, une salivation excessive et de la déglutition, et les retards de la parole (NIH). La cause sous-jacente de CP est considéré commeun manque d'oxygène et / ou du flux sanguin vers le cerveau au cours de la période de pré- ou péri-partum, ou jusqu'à postpartum un an. En outre, l'inflammation est maintenant considéré comme un élément clé dans le développement du CP.

La majorité des cas de CP sont associés à blanc dégâts de matière autour des ventricules, connus sous le nom leucomalacie périventriculaire (PVL). Cette caractéristique neurologique suggère que l'agression initiale menant à CP se produit au cours de la période de développement du cerveau lorsque les oligodendrocytes sont les plus vulnérables à l'insulte. La période de croissance des oligodendrocytes rapide chez un être humain, aussi la période où les oligodendrocytes sont les plus vulnérables aux blessures, est entre 24 – 32 semaines de gestation. Dans le rongeur, la période équivalente est jours post-natal 2 – 7 7, et lorsque CP est induite dans ce modèle.

Le modèle de souris néonatale du CP qui a été utilisé pour effectuer les essais décrits ici combine l'hypoxie et l'ischémie à l'inflammation pour créer un injury qui imite mieux la neurodégénérescence vu dans le CP humain. Ce modèle répond à certaines des principales lacunes observées dans d'autres modèles animaux de CP, qui manquent de déficits distincts à moteur qui ressemble à des patients humains CP, ainsi que distincte des dommages de la substance blanche. Des études antérieures par un collaborateur en utilisant le même modèle ont démontré que l'ajout de l' inflammation améliore blanc atteinte de la substance, ainsi mieux émuler le PVL vu chez les enfants avec CP 8. Se fondant sur les données antérieures, ce document présente une batterie complète de tests de moteur néonatals afin d'évaluer les changements de comportement du moteur que l'animal vieillit.

Protocol

NOTE: Toutes les chirurgies animales ont été effectuées en conformité avec ULAIRE département et IACUC politiques et procédures de l'Université Temple. C57BL / 6 barrages et taureaux ont été achetés auprès de Charles River Laboratories et ont été logés dans des cages d'élevage avec un 12 h cycle lumière / obscurité (lumière sur 7h00-19h00) avec accès libre à la nourriture et de l'eau. Les couples reproducteurs produits la taille des portées entre 5 – 10 chiots. Chirurgie 1. paralysie cérébrale Induction NOTE: La paralysie cérébrale a été induite en utilisant jour post-natal (DPN) 6 souriceaux, comme décrit précédemment 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia). Placez un chiot dans un bol en verre sur la glace avec un laboratoire essuyez pour protéger la peau du chiot. Vérifiez plan anesthésique approprié par pincement des pieds et le manque de mouvement. Déplacer le chiot à un pack de glace rembourrée pour la chirurgie. Stériliser la peau du chiot en utilisant 70% d'éthanol. Une fois sec, utiliser un bla chirurgical stérile # 11de et faire une incision de 1 cm dans le cou. L'utilisation d'un microscope chirurgical stéréoscopique, isoler la droite artère carotide commune avec un petit crochet et cautériser en utilisant un cauterizer portable à main. Visuellement confirmer que l'artère est occluse. la chirurgie Sham comprend la visualisation et l'isolement de l'artère carotide commune sans cautérisation. Réaligner la peau et à proximité en utilisant de la colle de suture (n-butyl cyanoacrylate). Placez le chiot sur un 34 o C pad de chauffage pendant 30 min pour surveiller la respiration spontanée et le mouvement normal. Retour le chiot (s) au barrage pendant 30 min. Placez les petits sur un coussin chauffant ou un autre dispositif de chauffage fixé à 34 o C à l' intérieur d' une chambre d'hypoxie fixé à 6% d' oxygène pendant 35 min. L'oxygène est remplacé par de l'azote. Surveiller de près le niveau chambre à oxygène et de la température pour les résultats de blessures cohérentes. Retirer les chiots de la chambre de l'hypoxie et les retourner au coussin chauffant. Intrapéritonéale injecter lipopolysaccharide diluée dans une solution saline stérile à 1 ug / kg et retourner le chiot au barrage. les injections simulées sont des injections de sérum physiologique uniquement. 2. Tests Neonatal moteur NOTE: Le PND 8, 48 heures après l'induction CP, souriceaux sont testés pour le développement neurocomportemental. Pups sont testés dans un bloc de 4 heures avant midi afin d'éliminer le temps des différences de jour dans le comportement. Les petits sont retirés du barrage pour pas plus de 15 minutes à une heure pour éviter la perte rapide des problèmes de chaleur du corps et de la faim / séparation. En outre, les chiots sont autorisés à se reposer entre les deux essais afin que les efforts maximaux seront suscité sur chaque test. La base des tests moteurs néonatales est adapté en utilisant la batterie de Fox de tests 10,11 et l'adaptation de Wahlsten des tests de Fox 12, ainsi que des publications de TREAT-NMD et d' autres comportements (comme indiqué dans le texte pour chaque test). La batterie de tests Fox sont appropriés pour DPN 2 – 21. Parmi les tests de Fox, la pâtey présente ici comprend: réflexe de redressement, réflexe d'agrippement, géotaxie négatifs (appelés vertical test de l'écran dans la batterie de Fox) et quatre membres la force de préhension (modifié à partir des essais d'escalade de l'écran Fox et Wahlsten de). Ici, la marche, la force première branche, et la force des membres postérieurs sont également testés pour distinguer le comportement moteur réflexive entre simulacre et CP souris chiots. Pour éliminer les améliorations sur les essais en raison de l'apprentissage, des tests ont été limités à un maximum de 3 essais où noté. Tous les autres tests avaient un seul essai par animal. Déambulation (Figure 1) (adapté d'un protocole de rat 13): NOTE: Ramper est un comportement développé au début du chiot de la souris entre DPN 0-5, au cours de laquelle des souris de points commencent à passer à la marche, à partir de 5 – 10 jours anciens 14. A DPN 8, le test de ambulation tire parti de cette évolution dans le temps de transition. Déambulation peut, cependant, être marqué tout au long de la durée de vie d'une souris et peut être déterminée à tout âge.Comme il n'y a pas de possibilités d'apprentissage, le test de la marche peut être répétée autant de fois que nécessaire tout au long de l'expérience. Placez la souris dans une enceinte où les souris sont clairement visibles à partir du haut, ainsi que le côté. Utilisez une poussée douce en touchant la queue du chiot pour motiver le chiot à marcher. Note ambulation pendant 3 minutes en utilisant l'échelle suivante: 0 = pas de mouvement, 1 = ramper avec les mouvements asymétriques, 2 = exploration lente, mais les mouvements des membres symétriques, et 3 = ramper rapide / marche. REMARQUE: Ici, le mouvement des membres symétrique est décrit dans lequel pattes arrière se rencontrent au cours de chaque étape frontpaws, et chaque pas en douceur la transition à l'étape suivante. Une souris affichant un mouvement de membre asymétrique a placement de patte erratique et les transitions d'une étape à l'autre ne sont pas lisses. Figure 1. La transition deCrawling à la marche peut être distingué en observant la patte arrière, ainsi que la tête et de queue. (A) Au cours de l' exploration, l'ensemble de patte arrière, des orteils au talon, touche le sol lorsque ambulantes, comme indiqué par (*). Un motif de marche adulte est vu quand seulement les orteils et la partie avant de la patte arrière touchent le sol (le talon est élevé, deonoted par [**]). (B) La tête et la queue d'une souris rampant est au ras du sol. La tête commence à augmenter au cours de la transition de l'exploration à la marche. La transition est terminée lorsque la tête et la queue sont élevés et que l'avant de la patte arrière touche le sol. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Hindlimb Angle Foot (Figure 2) NOTE: Il y a un changement de développement apparent dans la posture de hindlimb comme nymee mûrit de ramper à la marche, où les membres postérieurs sont placés sous le corps lors de la marche et l'angle entre le hindlimbs est inférieur à l'angle vu dans l'analyse. Même si l'angle hindlimb pieds change au fil du temps, les chiots de souris du même âge avec des blessures ou des maladies différentes peuvent être comparés. Comme pour le test de la marche (3.1), il n'y a pas de potentiel d'apprentissage. Ainsi, le test de l'angle du membre postérieur du pied peut être répété autant de fois que nécessaire tout au long de l'expérience. Soit dans une zone de plein champ clair ou un espace clos, monter une caméra vidéo ci-dessous ou au-dessus, respectivement, pour enregistrer le chiot comme il se déplace autour du terrain. Utilisez une poussée douce en touchant la queue du chiot pour motiver le chiot à marcher. Record pour deux minutes. Utilisation des enregistrements vidéo, mesurer l'angle de pied des chiots en traçant une ligne à partir de la fin du talon / tibia à la pointe de la plus longue (au milieu) orteil. Seulement prendre la mesure lorsque le chiot effectue une foulée complètedans une ligne droite et les deux pieds sont à plat sur le sol. Ne prenez pas des mesures tandis que le chiot est stationnaire ou pendant que le chiot tourne. Mesurer trois à cinq ensembles d'angles de pied et de calculer l'angle moyen pour chaque chiot testé. Figure 2. Angle membres postérieurs pied peut être utilisé pour déterminer Gait Anomalies. L'angle de pied peut être mesurée en traçant une ligne à partir de la mi-talon par le milieu ( le plus long) chiffres. Les animaux blessés ont un plus grand angle de pied par rapport à la normale (voir résultats représentatifs, Angle des pieds). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Righting de surface (Figure 3): NOTE: Le réflexe de redressement est la capacité du moteur pour un chiot de la souris pour être en mesure de retourner sur ses pieds à partir d'une position couchée. L'âge moyen pour le réflexe de redressement à apparaître chez les rongeurs est DPN 5 avec une gamme de PND 1 -. 10 15 Comme ce test est un réflexe, il n'y a pas de composante d'apprentissage et il peut être répété tout au long de la période d'expérimentation. Placez les petits sur le dos sur un tapis de feuille de coton ou de banc et maintenir en position pendant 5 secondes. Relâchez les chiots et enregistrer le temps que prend le chiot à revenir à la position couchée, ainsi que la direction de redressement (à gauche ou à droite). Un total de une minute est donnée pour chaque essai, le cas échéant. Répétez l'opération pour un total de trois essais. Figure 3. Righting de surface. Ce test nécessite le contrôle du tronc et peut tester les déséquilibres posturaux. patients CP humains peuvent avoir des déficits dans leur noyau.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Géotaxie négatif (figure 4) NOTE: L'âge moyen des géotaxie négatif réflexe à apparaître chez les rongeurs est DPN 7 avec une gamme de PND 3-15 15 Le test de géotaxie négative évalue la coordination motrice chez les jeunes souris.. Les souris sont placées en regard sur une pente et, en raison des indices vestibulaires de la gravité, les chiots se tournent pour faire face à la pente. La réponse au stimulus, ou les taxis, est un comportement inné. Placez le chiot avec sa tête pointant vers le bas sur une pente de 45 o et maintenez – le pendant 5 sec. Relâchez le chiot et enregistrer le temps et la direction du chiot se tourne vers le haut. temps de test total est de 2 min. Répétez l'opération pour un total de trois essais. Les souris qui tombent en bas de la pente ou ne parviennent pas à tourner peut être re-testé, éliminés, ou donné un score nul. NOTE: Cette décision est lauche à l'examinateur, que parfois les chiots va rouler sur la pente en raison de la somnolence plutôt que de faiblesse. Une fois que la décision est prise sur la façon de marquer les petits qui tombent sur la pente, il convient de noter dans les méthodes et devrait être cohérente dans l'essai de tous les sujets. Figure 4. Négatif géotaxie. Le moteur et l' entrée vestibulaire est nécessaire pour la souris de reconnaître son orientation sur une pente et tourner autour. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Front-branche Suspension (Figure 5) 16; adapté de 17, 18: NOTE: Front-branche suspension teste la résistance à la forelimb des chiots, y compris le bras et la force de la patte. Tson test est pas recommandé pour les chiots de moins de DPN 10 15. Les petits sont autorisés à saisir un fil tendu à travers un objet stable et accrocher sur le fil avec les deux pattes. La zone d'essai est sur une zone de dépôt rembourrée. Le test peut détecter des différences de résistance latérale droite / gauche. L'apprentissage et l'absence de renforcement négatif peut conduire à une augmentation de la non-participation. Les souris qui tombent immédiatement lorsqu'il est relâché ou l'échec à saisir lorsqu'il est placé sur le fil sont indicatifs de non-participation. Tenir les chiots fermement par le corps et leur permettre de saisir le fil avec les deux pattes. Relâchez le chiot. L'utilisation d'une minuterie ou d'un chronomètre, enregistrer le temps total à l'automne, ainsi que la patte de faiblesse. NOTE: Paw faiblesse est déterminé si un chiot tombe toujours du fil avec une patte avant l'autre plutôt que de libérer du fil avec les deux pattes en même temps. Répéter le test pour un total de trois fois. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 5. Front-Limb Suspension. Ce test de suspension provoque des tensions dans les forelimbs jusqu'à ce que la fatigue musculaire. Avec cette approche, la force de base dans les forelimbs sont établis. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La suspension des membres postérieurs (figure 6): NOTE: Ce test de suspension détermine la force de hindlimb. Il est un test conçu spécifiquement pour les nouveau – nés et a été initialement utilisé sur les animaux entre DPN 2-12 19,20, mais peut être adapté pour les souris jusqu'à DPN 14. Ce test peut détecter droite / gauche différences de résistance des membres postérieurs, ainsi que la fonction neuromusculaire. Un cône de 50 ml standard est utilisé, rembourré avec des lingettes de laboratoire. Comme pour le test de suspension avant-membre, ce test peut être appris, surtout le péchéCE il n'y a pas des conséquences négatives à la baisse. Ainsi, l'augmentation de la non-participation, comme on le voit par les souris qui tombent dès libéré ou non rester lorsqu'il est placé sur le bord du tube, peut être noté. L'utilisation d'un 50 ml conique, lieu chiot doucement face vers le bas dans le tube avec ses pattes arrières suspendus au-dessus de la jante. Relâchez le chiot. Observez la posture des membres postérieurs. Score posture selon les critères suivants. NOTE: Un score de 4 indique la séparation hindlimb normale avec la queue relevée; Le score de 3 signifie faiblesse est apparente et hindlimbs sont rapprochés, mais ils touchent rarement les uns des autres; Le score de 2 indique hindlimbs sont proches les uns des autres et souvent touchante; score de 1 montre une faiblesse est apparente et les membres postérieurs sont presque toujours dans une position jointes avec la queue relevée; un score de 0 indique clasping constante des hindlimbs avec la queue abaissée ou non tenue sur le tube pour toute période de temps. Comte tire si nécessaire. Une traction est qualIfied lorsque le chiot tente de lever son corps en utilisant ses hindlimbs alors qu'il était suspendu sur le côté du tube conique. L'utilisation d'une minuterie ou d'un chronomètre, enregistrer le temps de latence à l'automne. Répétez l'ensemble du test en trois exemplaires. Figure 6 membres postérieurs suspension. (A). Ce test de suspension provoque des tensions dans les hindlimbs jusqu'à ce que la fatigue musculaire. La force de base et de la posture dans les hindlimbs sont établies. (B). La notation. Notez les numéros ci – dessus les souris représentatives démontrant le score possible de posture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Force de préhension (Figure 7): NOTE: Ce test examine la patte sORCE des quatre pattes en même temps. Un fil d'écran 16 x 18 en fibre de verre est utilisé. L'âge moyen pour un rongeur pour pouvoir saisir un écran horizontal est DPN 8 avec une gamme de PND 5-15 15 Fox a utilisé le test de l' écran horizontal quatre membres du PND 2 -.. 21 10 Ce test est modifié de la norme horizontale test d'écran; ici l'écran est tourné lentement d'une horizontale à la position verticale, de contester la saisie des quatre membres 21; adapté de Corti S 16. Si la souris tient à l'écran de maille lorsqu'il est renversé à 180 °, enregistrer le temps de latence à l'automne. En outre, notez le poids du corps. Une impulsion suspendue peut être calculée comme [poids (g) x temps de latence à tomber (s)] qui reflète la force nécessaire pour résister à la pesanteur. L'utilisation d'un morceau de treillis métallique, placez le chiot à l'écran. Laisser le chiot à adapter à cet environnement pendant environ 5 secondes. Inversez l'écran lentement à 180 degrés. Notez la angl approximativee de l'écran lorsque le chiot tombe. Répétez l'opération pour un total de trois essais et la moyenne des essais. Figure 7. Force de préhension. Les souris sont nécessaires pour maintenir la tension musculaire dans les quatre membres comme force augmente gravitationnelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Grasping Reflex (Figure 8) NOTE: Le réflexe de préhension apparaît généralement chez les rongeurs à DPN 7 avec une gamme de PND 3-15 15 Chaque patte est testée individuellement, donc le test peut révéler des problèmes avant ou, membres postérieurs ainsi que les questions de unilatéralité.. Comme il est un réflexe, ce test peut être répété jusqu'à ce que le réflexe apparaît. Il est peu enclin à l'apprentissage. Comme une mise en garde importante, ce test ne distingue pas la force de préhension, seulement la capacité, et doit être testé avant 15 jours d'âge lorsque les souris juvéniles commencent à saisir en raison de craindre une réponse. Garder la souris par la peau du cou, semblable à la manière d'un chiot de la souris est porté par le barrage. Cette attente provoque le chiot à devenir instinctivement immobile et détendu, ce qui permet pour la facilité d'essais. Stroke chaque patte du chiot avec le franc, côté d'une lame de rasoir arrondie. Testez chaque patte individuellement et enregistrer la présence ou l'absence de saisie et de marquer 1 point par patte avec laquelle les poignes de souris. NOTE: La notation de la préférence de la patte droite est de 100% pour la préférence de la patte droite, – – -100% pour la préférence de la patte gauche, 50% pour les deux pattes de préhension, et 0% pour aucune des pattes de préhension. L'équation pour déterminer ces nombres est [(patte droite – patte gauche) / (patte droite + patte gauche + deux pattes)] x 100%. /53569/53569fig8.jpg "/> Figure 8. Grasping Reflex. Parce que les souris néonatales n'ont pas une réaction de peur forte, ce test détermine strictement le réflexe plantaire / palmaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Cliff Aversion (Figure 9): REMARQUE: les tests d'aversion Cliff labyrinth réflexes, ainsi que la force et la coordination et peuvent être utilisés pour tester les chiots de DPN 1-14 22. Une boîte pré-parfumée (une boîte où un minimum de 5 souris ont été autorisés à se promener librement) avec un rebord surélevé plat est utilisé et le chiot est placé avec les chiffres seulement de leurs pattes et leur museau positionné au-dessus du bord. La notation est effectuée en comptant le temps total qu'il faut le chiot à se détourner de la falaise et déplacer ses pattes et le museau loin du bord. Si aucune réponse est observée après 30 secondes, l'essai est terminé.Si le chiot tombe du bord, un seul essai supplémentaire peut être réalisée. L'utilisation d'une vue de côté, placez le chiot sur le bord de la boîte pré-parfumée, faire en sorte que les pattes, les chiffres et le museau sont les seules parties sur le bord. Relâchez chiot et commencer à minuterie. Une fois à la fois le museau et les pattes ont été enlevés du bord, arrêtez le temps de la minuterie et enregistrer. Répétez test pour un total de 3 essais. Si le chiot ne se déplace pas loin de la falaise dans les 30 secondes, aucun score est donné. NOTE: La détermination si le chiot est un non-participator contre facultés affaiblies est laissée à la discrétion de l'examinateur. La hauteur de la falaise peut être ajustée pour l'âge du chiot pour assurer la sécurité du chiot. Une plus petite hauteur peut être utilisé avec un «plancher» noir pour émuler une plus grande hauteur. Figurdéséquilibres e 9. Cliff Aversion. vestibulaires sont mesurés en utilisant le test falaise d'aversion. Ici, les yeux du chiot sont encore fermés alors la peur est pas le facteur déterminant de se détourner du bord de la falaise. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 3. Signification statistique L'utilisation d'un logiciel statistique analyser les résultats. Exprimer les données comme moyen ± erreur standard de la moyenne (SEM). Tests sont paramétriques et donc, d'examiner les données en utilisant des analyses t-test. NOTE: Les expériences ne sont pas conçus pour tester les différences entre les sexes. Les différences sont considérées comme statistiquement significatives lorsque p <0,05.

Representative Results

Les souris ont été testés à partir de P7 (24 h de suite d'une chirurgie) à P13 (1 semaine après la chirurgie), en utilisant des souris différentes pour chaque point de temps de sorte que l'apprentissage d'un paradigme de test n'a pas été un facteur de confusion. P8 a été choisi comme des résultats représentatifs, comme les souris ont montré les plus grands déficits à ce point de temps. Transition de Crawling à la marche est retardée en CP souris néonatale patients CP humaines présentent des anomalies de la démarche, allant de la pointe-pied à une démarche scissored. Comme ce modèle CP affiche la démarche des déficits semblables à l'homme, la marche a été évaluée. Les souris ont été marqués sur la symétrie démarche et le mouvement des membres de la patte lors d'une promenade droite. A 48 heures la chirurgie (DPN 8) suivante, les souris CP avaient moins de mouvement des membres symétrique et un «rampant» la démarche par rapport à leurs homologues fictifs (score moyen de ambulation: CP 1.083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1.639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, figure 10). En une semaine CP et souris sham ont fait la transition à la marche (données non présentées). Pups Figure 10. CP souris n'ambulate pas aussi bien que Shams. Souris Sham (barre noire) ont un score moyen de 1,639 ± 0,4859 (n = 9), ce qui signifie leur développement ambulatoire se situe entre les mouvements des membres asymétrique et exploration lente. souris CP (barre grise) reçoivent une note moyenne de 1,083 ± 0,6337 (n = 12), ce qui signifie leur ambulation est moins développée et ont tendance à avoir un mouvement de membre asymétrique. Les données sont exprimées en moyenne ± ETM; * Est p <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Hindlimb Angle Foot est augmenté au CP En plus de la marche, hindlimb pied-angle a été évaluée. Huit jours-vieux chiots simulacre de souris à pied avec leurs pattes arrière vers l' avant, par rapport à des souris HIL, qui ont évasés pattes arrière lors de la marche en ligne droite (Figure 2; angle moyen: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs sham 54,54 ± 8,043, n = 11, p <0,0001, figure 11). Cet angle a augmenté en corrélation avec la démarche instable, en ce que les chiots ont besoin d'augmenter l'angle de leurs pattes arrière afin de stabiliser leur démarche et d'aider à l'équilibre et la coordination. Figure 11. CP Souris Pups Splay leur pattes arrière lors de la marche. Les souris CP (barres noires) ont un angle moyen entre leurs hindlimbs de 77,48 ± 8.043 (n = 11), alors que les souris sham (b gris ars) ont un angle moyen de 54,54 ± 9,848 (n = 9). Les données sont exprimées en moyenne ± ETM; **** Est p <0,0001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Souris CP Ne pas afficher Déficits lorsque Righting Surface Le test de redressement de surface a été inclus en tant que certains patients atteints de CP ont entravé le contrôle du tronc (Heyrman et al., 2013). En outre, le système vestibulaire est nécessaire de détecter la nécessité d' un redressement et il y a des déficits vestibulaires chez certains patients atteints de CP 23. souris CP ne montrent pas des déficits importants lors de redressement par rapport aux contrôles fictifs (données non présentées). Souris CP effectuer les mêmes que Sham dans Testing géotaxie négative t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> géotaxie négatif est utilisé pour tester la coordination motrice chez les jeunes chiots Les souris sont remis en cause par être lieu face à la pente sur une surface inclinée Retard ou défaut de montée orient pourrait indiquer des déficits.. en coordination, l'équilibre, ou de l'entrée vestibulaire. les souris CP montrent aucun déficit en cas de contestation avec géotaxie négative par rapport à des souris fictives (données non présentées). en outre, les souris CP n'a pas montré une préférence à se tourner vers un côté par rapport à l'autre lors d'une nouvelle orientation . Front-Limb Suspension Test est appropriée pour les souris âgées de 10 jours les patients atteints de CP ont une diminution du tonus musculaire et les déficits dans la motricité fine, telles que la saisie. Pour tester la faiblesse dans ce modèle de souris, nous avons utilisé un test de suspension avant-membre. En outre, ce modèle utilise une lésion ischémique unilatérale et face-ness pourraient être déterminées à l'aide de ce test de suspension. Ce testest meilleure pour les souris âgées de 10 jours 15. À l'âge de 8 jours, deux jours après la blessure, il n'y avait pas de différences significatives entre le CP et les souris sham (données non présentées). Force est hindlimb Diminué chez la souris CP patients CP humaines ont souvent besoin des accolades ou des dispositifs d'assistance à pied en raison de l'absence de contrôle du moteur et la force. Afin de comparer le modèle de rongeur CP pour l'être humain, la résistance à la patte arrière a été évaluée en utilisant le test de suspension des membres postérieurs. Lorsque suspendu à partir du côté d'un tube conique, les souris CP ont montré la faiblesse des membres postérieurs, comme l'a démontré par une diminution du score accroché (hindlimb partition suspendue: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, figure 12). Aucune différence n'a été observée dans le temps de suspension des membres postérieurs (données non présentées). Ainsi, même pour les patients CP humains, les souris CP démontrent hindlimb (jambe) faiblesse. Figure 12. Souris Sham sont légèrement mais significativement plus forte dans leurs hindlimbs que les souris du CP. A un score moyen de suspension de 3,891 ± 0,1329 (n = 13), les souris sham (barre noire) montrent une séparation plus hindlimb, et donc une hindlimb position plus ferme, en accrochant sur le bord d'un tube que les souris CP (barre grise) avec un score moyen de suspension de 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Les données sont exprimées en moyenne ± ETM; * Est p <0,05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Grip Force est diminué à la suite des blessures CP Saisir avec les quatre pattes est important pour un rongeurtermes de l'escalade et en cours d'exécution sur des surfaces irrégulières. Grip exige de la force soutenue significative, plutôt que de la dextérité ou la force linéaire, principalement dans les chiffres et les pattes 24. Les souris ont été nécessaires pour maintenir leur poids corporel sur un écran de treillis métallique inversé. Souris CP ne sont pas en mesure de maintenir leur emprise et ces souris sont tombées à des angles nettement inférieurs (angle moyen de quatre membres: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs sham 96,57 ± 10.836, n = 9; p <0,05, figure 13). Ces données montrent qu'il existe un déficit important en force de préhension chez la souris du PC. Figure 13. Souris CP ont Grip Plus faible que Shams. Souris Sham (barre noire) peut saisir un angle inversé moyenne de 96,57 ± 10,836 (n = 9). souris CP (barre grise) ne peuvent atteindre un angle inversé de 75,627 ± 24,48 (n = 11). Les données sont exprimées en moyenne ± ETM; * P est0; 0.05. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Déficits Grasping réflexes sont apparente chez la souris CP Avec des déficits de motricité globale, les mouvements de motricité fine sont également altérées chez les patients atteints de CP 25,26. Le réflexe de préhension chez l'homme est présent à la naissance et disparaît environ 5 – 6 mois. Cependant, les changements dans le réflexe de préhension, telles que la vitesse exagérée ou la force de préhension, incapacité à saisir, ou la réémergence du réflexe de préhension après 6 mois d'âge, indiquent tous les dommages au système nerveux. Pour comparer saisir dans le modèle de CP, les déficits de préhension réflexives ont été déterminées. A 48 heures après la blessure, les souris CP démontrent une diminution réflexe d'agrippement (pattes moyennes saisiesà 48 h: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs sham 3.214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, figure 14A). Il y avait une augmentation légère, mais non significatif dans le droit de préférence de la patte dans les pattes (données non présentées). Il y avait une préférence de patte droite significatif dans les pattes arrière (CP 75,0 ± 42,74, n = 14, vs sham 17,86 ± 54,09, n = 14; p <0,005, Figure 14B). Une semaine après la lésion, les souris CP montrent des déficits de préhension (pattes moyennes saisies à 1 semaine: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0,05, figure 14C), avec pas de préférence la patte notable . Figure 14. Les souris CP ont Déficits saisir, dans le controlatéral, pattes arrière à la région du cerveau blessé. (A) 48 h blessure suivante (DPN 8), les souris CP (barre grise) saisir un bâton avec, en moyenne, moins de pattes que sham ANIMAls (barre noire). souris (B) CP (barre grise) affichent une préférence pour saisir avec le patte arrière droite (controlatéral à la blessure) par opposition à l' aide de la patte arrière gauche (ipsilatéral à la blessure). souris Sham (barre noire) ne présente pas cette préférence de la patte droite. Droit de préférence la patte est calculé comme ([patte droite – gauche patte] / [patte droite + patte gauche + deux pattes] * 100) (C) Une semaine de blessures suivantes, les souris CP (de barre grise) encore montrer saisir les déficits par rapport à. shams (barre noire). Les données sont exprimées en moyenne ± ETM; * Est p <0,05, ** est p <0,005. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Les souris CP se détournent du bord Pendant Aversion Cliff Le test falaise d'aversion repose sur la peur inhérente de la souris pour tourner away d'une falaise abrupte et se diriger vers la sécurité. Bien que certains patients atteints de CP ont des difficultés vestibulaires, ainsi que le contrôle moteur avec facultés affaiblies, les souris CP n'a pas montré de déficits sur ce test.

Discussion

En utilisant des modèles animaux pour étudier les maladies humaines est pertinent que s'il y a un chevauchement entre la réponse cellulaire et moléculaire entre l'homme et les rongeurs et que les tests comportementaux réalisés ont un intérêt direct pour les symptômes humains. Un des problèmes majeurs avec des études de maladies pédiatriques est que de nombreux chercheurs utilisent des rongeurs adultes pour créer le modèle, ainsi que des rongeurs adultes évaluation comportementale, sans tenir compte des différences de développement qui peuvent être importants pour le processus de la maladie. En raison de ces problèmes, il est important que la recherche sur l' utilisation de la maladie pédiatrique non seulement le temps des points de développement approprié ajusté (par exemple, le développement du système nerveux central humain à 28 – 32 semaines est équivalent à un jour post-natal 2-7 jour rongeurs) 7, mais aussi des tests comportementaux qui examineront moteur approprié, les comportements de développement sensoriel ou réflexive. Ainsi, chaque nouveau modèle de maladie néonatale est développé, il doit être testé de façon rigoureuse pour assurer que le cellulaireet les réponses comportementales fourniront les données traduisibles les plus appropriés entre les rongeurs et les humains.

La paralysie cérébrale est un trouble moteur, qui persistent à l'âge adulte. Un problème avec la plupart des modèles de paralysie cérébrale disponibles aujourd'hui est le manque de tests de moteur répétable, normalisé qui peut corréler avec les déficits observés chez les patients pédiatriques. Dans ce nouveau modèle, qui combine une hypoxie, une ischémie et une inflammation chez une souris néonatale, le comportement du moteur a été évaluée en utilisant une batterie de tests spécifiques pour les souris nouveau-nés. Afin de réduire la subjectivité et d'accroître la déclaration quantitative, plusieurs tests ont été modifiés pour inclure très spécifique, mais facile à évaluer les mesures qui peuvent être standardisés. En outre, les évaluations guichet et membres postérieurs peuvent être effectuées séparément, et les différences gauche / droite peuvent être déterminées. Cette batterie de tests est spécifique pour les souris néonatales jusqu'à deux semaines d'âge.

Ce modèle de CP démontredifficulté à marcher (ambulation, angle de pied hindlimb), ainsi la faiblesse des membres spécifiques (quatre membres suspension, hindlimb suspension), et les déficits des réflexes de développement (réflexe de préhension). Bien que dans cette étude une seule timepoint a été examinée, ces déficits peuvent être suivis au fil du temps.

Il existe d' autres batteries de tests qui peuvent être utilisés sur le nouveau – né, comme la batterie de la Fox de tests ou d'évaluation de Heyser des étapes clés du développement 15. Cependant, ces tests comparent le nouveau-né à l'adulte, dont les réponses ne peuvent pas être les mêmes parce que le nouveau-né est encore en développement. La batterie de Fox et les tests de Assement de HEYSER reposent sur l' information subjective d' observation avec dichotomique (oui ou non) l' évaluation, plutôt que des données objectives (angle, posture basé sur la force, etc.). En raison de la subjectivité de ces tests, de nombreux scientifiques se sont adaptés, ajoutés ou supprimés des critères, ce qui rend leurs résultats incomparables aux autres et à la limitement l'utilité des données en termes d'établir un déficit de base pour une maladie ou d'un trouble particulier. En établissant un ensemble de tests moteurs standardisés qui sont qualitatives et spécialement conçu pour tester les nouveau-nés, les résultats des groupes de recherche individuels peuvent être rapportés avec précision et fiabilité et comparées.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank everyone at Shriners Hospital Pediatric Research Center, in particular Dr. Mickey Seltzer, of whom without his support, this work would not have been funded. In addition, we would like to thank Isha Srivastava, who contributed to early data collection and Amy He, who helped with the figures. This study was funded by Shriners Hospitals for Children. No funding source played a role in experimental design or decision to submit the paper for publication.

Materials

C57BL/6 mice Charles River Laboratories STRAIN CODE: 027  C57BL/6NCrl is the exact strain we use
Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish Corning Life Sciences Glass  3140125 Capacity: 25.03 oz. (740mL); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399).
Covered lead ring Fisher Scientific S90139C Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish.
Scalpel Blade #11 World Precision Instrucments, Inc. 500240
Small Vessel Cauterizer Fine Science Tools 18000-00
Micro Hook Fine Science Tools 10064-14
Vetbond Suture Glue 3M 1469SB n-butyl cyanoacrylate adhesive
Lipopolysaccharide Sigma Life Science L4391 Lipopolysaccaride from e.coli 0111:B4, gamma irradiated
12×12 inch opaque box Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics C4022 Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H;  http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html
Camera/camcorder JVC GC-PX100BUS Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder.
Covidien Tendersorb™ Underpads Kendall Healthcare Products Co 7174
WypAll L40 Kimberly-Clark Professional 5600 Any surface with moderate grip will do
Surface at 45 degree incline We use a cardboard box.
Thin wire from a pipe cleaner Creatology M10314420 Any pipe cleaner from any craft store will work.
50mL conical tube Falcon 352070
Fiberglass Screen Wire New York Wire  www.lowes.com 14436 Any supplier can be used as long as their screen is 16×16 or 18×16
Razor blade Fisherbrand 12-640 A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work.
OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway PLASKOLITE INC 1AG2196A Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2"x2"; (3) 2"x 18"; (1) 2"x15.5"; (1) 2"x3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning.
Protractor Westscott ACM14371
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
  2. Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
  3. Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  4. Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
  5. Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
  6. Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
  7. Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
  8. Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
  9. Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
  10. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  11. Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
  12. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
  13. Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, . Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
  14. Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
  15. Heyser, C. J., Crawley, J. Q., et al. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Chapter 8, (2004).
  16. Corti, S. . Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , (2014).
  17. Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
  18. Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
  19. El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
  20. El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), 29-43 (2008).
  21. Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
  22. Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , (2008).
  23. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. , (2016).
  24. Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
  25. Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
  26. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).

Tags

Neonatal Motor TestsCerebral PalsyMouse ModelAmbulationCrawlingHindlimb PostureFoot AngleRighting ReflexQuantifiable Scoring SystemMotor DeficitsInjury ModelDisease ModelTreatment Validation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feather-Schussler, D. N., Ferguson, T. S. A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy. J. Vis. Exp. (117), e53569, doi:10.3791/53569 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image