مجموعة من الاختبارات للسيارات في ماوس نموذج حديثي الولادة من الشلل الدماغي
Summary
Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.
Abstract
As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.
Introduction
تطوير نماذج جديدة من إصابة الأطفال أو المرض باستخدام القوارض غالبا ما يكون صعبا بسبب قدرة مذهلة على حد سواء الجرذان والفئران لاسترداد بسرعة من الإصابة العصبية. ولذلك، من أجل التحقق من صحة أي نموذج مرض جديد للأطفال، فحص بدقة التغيرات الخلوية والجزيئية يجب أن تذهب جنبا إلى جنب مع النتائج السلوكية. في نواح كثيرة، قد يكون الانتعاش السلوكي وظيفية أكثر أهمية من التغيرات الخلوية الأساسية من حيث أهميتها العلاجية أو متعدية. كما يتعلم الباحثون أكثر عن الإصابات في البالغين وحديثي الولادة، فمن الواضح أن إجاباتهم مختلفة جدا ولا يمكن استقراء بين البلدين. على سبيل المثال، الفئران حديثي الولادة عرض مستويات مختلفة من عامل نمو الأعصاب، عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ، neurotrophin-3 و الدبقية عامل التغذية العصبية المشتقة خط الخلية التالية إصابة الحبل الشوكي 1،2. بالإضافة إلى ذلك، حديثي الولادة لها كبير تسرب حاجز الدم في الدماغ بعد السكتة الدماغية 3، دemonstrate القشرية إعادة ترتيب الخلايا العصبية بعد الإصابة الأعصاب الطرفية 4، ولها دباق النجمي تأخير أو تباطؤ التالية إصابة الحبل الشوكي ونقص الأكسجة نقص التروية 5،6. وبالتالي، فمن المهم أن الأبحاث الأطفال متعدية استخدام نماذج تعادل تنمويا وأن تلك النماذج يتم تقييم لكل من التغيرات الجزيئية الخلوية / والاختبارات السلوكية المناسبة للفئة العمرية.
الشلل الدماغي (CP) هو اضطراب حركي يؤثر 3: 1000 ولادة حية سنويا (NIH). الأطفال يعانون من الشلل الدماغي المعرض مجموعة من الأعراض والظروف المشارك المهووسين، اعتمادا على شدة المرض. صعوبة في الحركة والتنسيق هي العلامات الأكثر شيوعا، جنبا إلى جنب مع التأخير في الوصول إلى المعالم التنموية السيارات. وتشمل علامات أخرى العضلات غير طبيعية (إما زيادة أو نقصان)، وانخفاض المهارات غرامة السيارات، وصعوبة في المشي، الترويل المفرطة والبلع، وتأخر الكلام (NIH). ويعتقد أن السبب الكامن وراء CP أن يكوننقص الأكسجين و / أو تدفق الدم إلى الدماغ خلال فترة ما قبل أو الفترة المحيطة بالولادة، أو ما يصل إلى سنة واحدة بعد الولادة. وبالإضافة إلى ذلك، يعتقد التهاب الآن أن تكون عنصرا أساسيا في تطوير الإنتاج الأنظف.
وترتبط معظم الحالات CP مع الضرر المادة البيضاء حول البطينات، والمعروفة باسم تلين حول البطينات الدماغية (PVL). وتشير هذه السمة المميزة العصبية أن إهانة الأولية مما أدى إلى CP يحدث خلال فترة نمو الدماغ عندما قليلة التغصن هي الأكثر عرضة للإهانة. فترة النمو السريع دبقية قليلة التغصن في الإنسان، وأيضا الفترة عندما قليلة التغصن هي الأكثر عرضة للإصابة، ما بين 24 – 32 أسبوعا من الحمل. في القوارض، والفترة المماثلة هي أيام بعد الولادة 2-7 يوليو، وليس عند يسببها CP في هذا النموذج.
نموذج الفأر حديثي الولادة من حزب المحافظين الذي تم استخدامه لإجراء الاختبارات المذكورة هنا يجمع بين نقص الأكسجين ونقص التروية مع التهاب لخلق ينجأوروغواي الذي يحاكي أفضل من التنكس العصبي ينظر في CP البشري. ويتناول هذا النموذج بعض أوجه القصور التي لوحظت في النماذج الحيوانية الأخرى من حزب المحافظين، والتي تفتقر إلى العجز الحركي المتميزة التي تشبه المرضى CP البشري، وكذلك متميز الضرر المادة البيضاء. وقد أظهرت دراسات سابقة من قبل متعاون باستخدام نفس النموذج أن إضافة التهاب يعزز الضرر المادة البيضاء، وبالتالي محاكاة أفضل PVL تظهر على الأطفال المصابين بالشلل الدماغي 8. بناء على البيانات السابقة، تعرض هذه الورقة على بطارية شاملة من اختبارات السيارات حديثي الولادة وذلك لتقييم التغيرات في السلوك الحركي والذين تتراوح أعمارهم الحيوان.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام نماذج حيوانية لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان هي ذات الصلة فقط إذا كان هناك تداخل بين الاستجابة الخلوية والجزيئية بين الإنسان والقوارض وأن الاختبارات السلوكية يؤديها لها صلة مباشرة الأعراض الإنسان. واحدة من القضايا الرئيسية مع دراسات أمراض الأطفال هو أن العديد من الباحثين استخدام القوارض الكبار لإنشاء نموذج، وكذلك تقييم السلوكي القوارض البالغين، دون النظر إلى الاختلافات التنموية التي قد تكون مهمة لعملية المرض. وبسبب هذه القضايا، فمن المهم أن البحوث حول استخدام أمراض الأطفال ليس فقط المعدلة التنموية نقاط الوقت المناسب (على سبيل المثال، وتطوير الجهاز العصبي المركزي الإنسان في 28-32 أسابيع ما يعادل يوم بعد الولادة 2-7 يوم القوارض) 7، ولكن أيضا الاختبارات السلوكية التي ستدرس المحرك المناسب، والسلوكيات التنموية الحسية أو انعكاسية. وهكذا، كما تم تطوير كل نموذج مرض المواليد الجدد، فإنه يجب أن يتم اختبار صارم لضمان أن الخلويةوالاستجابات السلوكية وتوفير البيانات للترجمة أنسب بين القوارض والإنسان.
الشلل الدماغي هو اضطراب حركي، والتي تستمر حتى سن البلوغ. مشكلة واحدة مع العديد من النماذج الشلل الدماغي المتاحة اليوم هي عدم وجود تكرار اختبار محرك موحد، التي يمكن أن ترتبط مع العجز ينظر في طب الأطفال المرضى. في هذا النموذج الجديد، الذي يجمع بين نقص الأكسجين، ونقص التروية والتهاب في الماوس حديثي الولادة، تم تقييم السلوك الحركي باستخدام مجموعة من الاختبارات المحددة للفئران حديثي الولادة. من أجل تقليل الذاتية وزيادة الإبلاغ الكمي، تم تعديل العديد من الاختبارات لتشمل محددة جدا، ولكن من السهل تقييم التدابير التي يمكن أن تكون موحدة. وبالإضافة إلى ذلك، التقييمات الأمامية وhindlimb لا يمكن أن يؤديها على حدة، ويمكن تحديد الفروق يسار / يمين. هذا من الاختبارات هي محددة لالفئران حديثي الولادة تصل إلى أسبوعين من العمر.
يوضح هذا النموذج CPصعوبة في المشي (التمشي، hindlimb زاوية القدم)، وكذلك الأطراف محددة ضعف (تعليق أربعة أطرافه، تعليق hindlimb)، والعجز في ردود الفعل التنموية (استيعاب رد الفعل). على الرغم من أن في هذه الدراسة تم فحص timepoint واحد فقط، يمكن تتبع هذا العجز مع مرور الوقت.
هناك بطاريات أخرى من الاختبارات التي يمكن استخدامها على حديثي الولادة، مثل بطارية فوكس من الاختبارات أو تقييم Heyser من مراحل تطور الطفل (15). ومع ذلك، هذه الاختبارات مقارنة الوليد إلى الكبار، الذين قد لا تكون هي نفسها لأن الوليد لا تزال تتطور الاستجابات. بطارية فوكس والاختبارات Assement Heyser وتعتمد على المعلومات الموضوعية الرصد مع تقييم شيئين (نعم أو لا)، بدلا من بيانات موضوعية (زاوية، الموقف القائم على القوة، وما إلى ذلك). بسبب subjectiveness هذه الاختبارات، وقد تكيفت العديد من العلماء، وأضاف، أو إزالة المعايير، مما يجعل نتائجها لا تضاهى للآخرين والحدجي فائدة البيانات من حيث إقامة العجز الأساسي لمرض أو اضطراب معين. عن طريق إنشاء مجموعة واحدة من التجارب الحركية الموحدة التي هي النوعية والتي صممت خصيصا لاختبار حديثي الولادة، والنتائج من المجموعات البحثية الفردية ويمكن الإبلاغ عن ومقارنة بدقة وبشكل موثوق.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank everyone at Shriners Hospital Pediatric Research Center, in particular Dr. Mickey Seltzer, of whom without his support, this work would not have been funded. In addition, we would like to thank Isha Srivastava, who contributed to early data collection and Amy He, who helped with the figures. This study was funded by Shriners Hospitals for Children. No funding source played a role in experimental design or decision to submit the paper for publication.
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740mL); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from e.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12×12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16×16 or 18×16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2"x2"; (3) 2"x 18"; (1) 2"x15.5"; (1) 2"x3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, . Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J., Crawley, J. Q., et al. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. . Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , (2008).
- Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
