Cultures Génération fibroblastes primaires de souris oreilles et la queue tissus
Summary
Nous décrivons une procédure expérimentale simple et rapide pour générer des fibroblastes primaires des oreilles et de la queue de souris. Le procédé ne nécessite pas de formation spécifique des animaux et peut être utilisé pour la production de cultures de fibroblastes des oreilles stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.
Abstract
Les cellules primaires sont directement dérivées de tissus et sont pensés pour être plus représentatif de l'état physiologique des cellules in vivo que des lignées cellulaires établies. Cependant, des cultures de cellules primaires ont habituellement une durée de vie limitée et doivent être fréquemment rétablie. Les fibroblastes sont une source facilement accessible de cellules primaires. Ici, nous discutons d'une procédure expérimentale simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. Le protocole peut être utilisé pour établir des cultures de fibroblastes primaires de l'oreille stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours. Lorsque le protocole est soigneusement suivie, les contaminations sont peu susceptibles de se produire malgré l'utilisation de tissus non stérile stocké pendant le temps prolongé dans certains cas. Fibroblastes prolifèrent rapidement dans la culture et peut être étendu à un nombre important avant de subir sénescence réplicative.
Introduction
Les cellules primaires sont obtenues à partir de tissu cultivé et vivant dans des conditions in vitro. Il est généralement admis que les cellules primaires ressemblent davantage à l'état physiologique et le fond génétique du tissu dont ils sont issus de lignées cellulaires tumorales immortalisées ou 1. Pour cette raison, les cellules primaires représentent un modèle utile pour étudier les questions biologique 2,3. Cependant, à la différence des lignées cellulaires établies qui poussent indéfiniment, cellules primaires éventuellement subir la sénescence dans la culture et doivent être fréquemment rétabli.
Les cellules primaires couramment utilisés comprennent les fibroblastes, les cellules epitheliales, les cellules endotheliales, les cellules T, les cellules B, les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) et des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (BMDC). Les fibroblastes sont souvent utilisés comme modèle de culture cellulaire primaire. Ils offrent des avantages clés par rapport aux autres cellules primaires. Les cultures de cellules sont faciles à établir, facilement maintenu et ne nécessitent aucune purification des cellules avant la culture. Ils ont la prolifération initiale rapide et aucune exigence pour les protocoles de moyennes ou d'activation spécialisées. Les fibroblastes peuvent être efficacement transfectées en utilisant des protocoles physiques 4,5 biologiques, chimiques, et. Il est possible de stocker les oreilles pour un maximum de 10 jours à la température ambiante avant d'établir des cultures de cellules. Cultures de fibroblastes sont propices à la visualisation des processus cytoplasmiques et adapté à la reprogrammation en cellules souches pluripotentes induites (iPS) 6.
Les fibroblastes sont des cellules importantes du tissu conjonctif qui sécrètent des protéines de la matrice extracellulaire de collagène et 7. Ils fournissent le cadre structurel dans de nombreux tissus 8 et jouent un rôle essentiel dans la cicatrisation et la réparation tissulaire 9,10.
Ici, nous décrivons un (<4 h) protocole simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes de les oreilles et la queue de souris 11. Le protocole nécessite un minimum de sourisl'expérience de récolter les tissus (contrairement à d'autres protocoles 12,13) et peut être utilisé pour établir des cultures de oreilles stockées dans un milieu à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous fournissons une procédure expérimentale simple, peu coûteux et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. L'extraction doit se traduire par des fibroblastes de division adhérentes et rapidement dans les 3 jours après l'isolement du tissu. Une limitation importante de cellules primaires est la sénescence, un arrêt de la croissance permanente 15. En utilisant le protocole, les cultures de fibroblastes peuvent être passées de 5 à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
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