Hela Mount Dissekering och Immunofluorescence i vuxen mus Cochlea
Summary
Vi presenterar en metod för att isolera den vuxna organ Corti som tre intakta cochlea varv (apex, mellersta och bas). Vi visar också ett förfarande för immunfärgning med fluorescerande taggade antikroppar. Tillsammans har dessa tekniker möjliggör studiet av hårceller, stödjande celler och andra celltyper som finns i snäckan.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
Den spiralformade snäckan i innerörat, som finns i temporalbenet, inrymmer Cortis organ, hörsel sensoriska änden organ i däggdjur. Snäckan är tonotopically organiserade och ofta delas in i apikal, mitten och basal vänder motsvarar olika frekvensområden med högfrekvent ljud upptäckt i botten och låg detektionsfrekvens i spetsen 1. Hårceller, de mechanosensory celler i organ Corti, kör längden på snäckan, vilket är cirka 6 mm långt i möss 2,3. Dessa celler omvandlar den mekaniska energin i ljudvågor, som sänds genom den vätskefyllda membranös labyrint, till neurala signaler som behandlas av centrala hörsel strukturer. Den teknik som beskrivs här ger en metod för att framställa hela monteringar av organ Corti efter förkalkning av cochlea är klar (för prover som sträcker sig från en veckas ålder till vuxen ålder). Vi presenterar också en metod för immunostaining alltsammans monterat cochlea vävnaden. Cochlear hela fästen är avgörande för visualisering av alla hårceller och omgivande stödjande celler i deras naturliga rumsliga arrangemang och möjliggöra analys i tre dimensioner med hjälp av konfokalmikroskopi.
Drs. Hans Engström och Harlow Ades beskrev ursprungligen en hel montera cochlea dissekeringsmetod 1966. De detaljerade en teknik för att snabbt fixa och dissekera förkalkad hörselsnäckor nedsänkt i vätska från en mängd olika däggdjur, bevara korta intakta delar av organ Corti för mikroskopisk analys 4. Dissektion av en ofixerade, förkalkad råtta snäckan har också visats i en instruktionsvideo 5. Drs. Barbara Bohne och Gary Harding vid Washington University gjort flera viktiga ändringar till denna metod. I sin version av cochlea hela berget metod, tinningbenet var avkalkades, inbäddad i plast, och fem halvvarv eller tio kvartsvarv var dissecTed 6,7. Dr Charles Liberman och kollegor på Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts öga och öra Infirmary, ändrat denna teknik så att plast inbäddning inte krävdes 8. Ytterligare modifiering av tekniken inträffade i Dr Jian Zuo labb vid St Jude Barnens Research Hospital 9-12 som informerade dissektion metod som presenteras här. Vi använder en annan strategi för att få tillgång till organ Corti än Bohne och Liberman, vilket möjliggör isolering av fullständig apikala, mitten och basala varv. Dissekerade vävnaden är alltså större och mindre benägna att förloras eller skadas under dissekering eller immunfärgning processer. Dessutom underlättar den nuvarande metoden mätning av avståndet från den apikala spetsen eller basala krok för att identifiera ett frekvensområde.
Även om många laboratorier utför immunfärgning av cochlea vävnad, är det oklart om detta förfarande har sitt ursprung. Som ett resultat finns det olika recept för att blockera buffers och antikropps inkubationsbuffertar som kan påverka resultatet för enskilda primära antikroppar. Här presenterar vi en metod för immunfärgning med fluorescerande taggade antikroppar som är tillämplig på de vanligaste antikroppar i hörselområdet.
Den komplexa formen av snäckan, delikat struktur organ Corti, och beniga inneslutning ger en utmaning för histologisk och biokemisk analys. En mängd olika tekniker används för närvarande i förhöret området att övervinna dessa svåra funktioner och visualisera celler i organ Corti, varje teknik med sina egna fördelar och nackdelar. Protokollet presenteras här möjliggör hela berget dissekering av den vuxna musen snäckan och med liten ändring, kan potentiellt användas för att undersöka de kritiska strukturer inom hörselsnäckor från en mängd andra modellorganismer som används inom området.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik hela montera dissekering och immunfärgning. Men innan någon av dessa metoder utförs, krävs korrekt fixering av cochlea vävnaden. Vi rekommenderar användning av metanol fri, ultrarent, EM klass PFA. PFA gjord av pulvret kan ha spår av metanol och en instabil pH som minskar kvaliteten på immunofluorescens. Andra grupper har också visat att liknande dissektioner är möjligt med fixatives som inte innehåller formaldehyd 14-16. Längden av fixerin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
