Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e são aprovados pelo Painel de Revisão Ética Cambridge. 1. Coleta de Amostras Configure acasalamentos programados usando 8-12 semanas de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6 com homens adultos (até 2 fêmeas para cada macho) à tarde. Verificar a presença de tampões vaginais como um sinal de cópula no início da manhã, nos seguintes dias. A presença de um plug no gd0.5 marcas manhã. Em gd9.5, sacrificar o animal por deslocamento cervical e a cavidade abdominal aberta. Note-se que a eutanásia por CO 2 pode causar vasodilatação. Use fio dental para ligar suavemente as artérias uterinas (figura 1, setas tracejadas). Amarrar o fio em volta das artérias na ponta de cada trompa uterina, proximal para os ovários, bem como em torno do colo do útero. Nota: Não ruptura dos vasos, pois isso pode resultar em artérias desabaram. <li> Dissecar o útero rapidamente usando tesouras de dissecação, extraindo todo o útero distalmente para os três pontos de ligação na ponta dos cornos uterinos e do colo do útero. Colocar o útero em um pedaço de poliestireno preparadas de tal modo que ambos os cornos estão alinhadas ao longo do mesmo eixo longo em direcções opostas a partir do colo do útero. Gentilmente esticá-lo e fixá no lugar usando 2-3 25 agulhas G. Mergulha-se o poliestireno em um tubo de 50 ml preparadas cónica. Encher a 50 ml com formalina a 10%. Fix para 5-6 horas à temperatura ambiente. Descartar a solução de formalina e substituir com 50 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) durante 5 min. Extirpar os dois cornos uterinos proximal ao ponto de ligação em cada extremidade e proximal do colo do útero no centro, aparar qualquer excesso de gordura ao redor dos locais de implantação e lavar duas vezes em PBS durante 5 minutos para remover traços de formol. Armazenar as amostras em etanol a 70% a 4 ° C (até duas semanas) até ao processamento. CUIDADO: Ethanol é altamente inflamável. Usar um sistema de processamento automatizado utilizando os parâmetros indicados no Quadro 1. Incorporar os chifres individualmente em parafina, de modo que eles podem ser cortados ao longo do plano perpendicular ao longo eixo do útero. Isto garante que a área máxima de cada local de implantação será exposto para análise no meio do bloco (Figura 2A). OPCIONAL: Este é um ponto de tempo conveniente para a randomização dos blocos se se desejar. Usando um micrótomo, corte cortes seriados de 7 de espessura mm a partir dos blocos. Manchar uma seção a cada intervalo de 49 mm com hematoxilina e eosina (H & E, ver secção 2.1). Armazenar os restantes secções à temperatura ambiente para a coloração SMA e outras aplicações a jusante. Solução Tempo Temperatura 70% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C 100% Etanol 1 hr 40 ° C : 21px; "> O xileno 1 hr 40 ° C Xileno 1 hr 40 ° C Xileno 1 hr 40 ° C Parafina 1 hr 63 ° C Parafina 1 hr 63 ° C Parafina 1 hr 63 ° C Parafina 1 hr 63 ° C Tabela 1:. Definições para processamento de tecidos automatizado Visão geral da configuração usada para o processamento de tecido uterino 2. SterAvaliação eological H & E Coloração Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de lâminas em um banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O xileno é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Este trabalho deve ser realizado em um exaustor, utilizando equipamento de protecção individual (EPI). Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 70% e água purificada durante 5 minutos cada. Imergir as lâminas em 50% Gill n 3 hematoxilina solução, diluiu-se com água purificada, durante 5 min. CUIDADO: Hematoxilina é nocivo por ingestão e contato com os olhos. Utilizar EPI adequado ao manusear. Lavar as lâminas em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. Imergir as lâminas em 1% de solução de ácido / álcool (1% de ácido clorídrico a 10 M em etanol a 70%) durante 10 sege lavar em uma calha de coloração em água corrente. Imergir as lâminas em solução de eosina para 30 seg e lavar em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. Dentro de um exaustor de fumos, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 70%, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio. Avaliação estereológica de tamanho do vaso e remodelamento Estado Para cada local de implantação, determinar quais seções estão perto do ponto midsagittal. O anexo corioalant�ca entre o feto ea placenta em desenvolvimento serve como um bom indicador do ponto midsagittal. Selecione 3 seções em 49 mm intervalos próximos ao ponto midsagittal para a análise. Digitalizar slides selecionados. A fim de evitar Including veias, que foram mostrados para ser mais perifericamente localizados nos locais de implantação 16, restringir a análise no centro de 2/4 de cada local de implante (Figura 2A). Para avaliar o tamanho do lúmen, desenhar em torno do interior dos vasos e gravar a área desta forma. Para o tamanho total do vaso, desenhar em torno da parede exterior do recipiente, incluindo as células endoteliais, pericitos e leucócitos intramurais. Nota: A relação entre o tamanho total do vaso de lúmen é um proxy para o status de remodelação de uma embarcação. Como os navios de bobina através do plano da secção que foi cortado ao longo, pode haver várias secções transversais da mesma artéria numa única lâmina. Evitar a medição da mesma artéria várias vezes. Grave as medições dos 5 navios em cada local de implantação com as maiores e mais redondos lumens. Meça cada local de implantação em triplicata (três seções espaçadas 49 mm afastados uns dos outros). A média destes 15 medições represeNTS o diâmetro médio dos vasos maiores. Para evitar sobre-representação de navios maiores em algumas amostras, meça o mesmo número de embarcações em cada local de implantação. 3. Avaliação Qualitativa Usando imunohistoquímica Desparafinização e reidratação Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de corrediça resistente ao calor num banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95% e 70% e com água purificada durante 5 minutos cada. Antigen Recuperação Preparar um tampão de citrato de sódio 10 mM em água purificada e ajustar até pH 6 utilizando ácido clorídrico a 10 M. Encha um recipiente resistente ao calor que pode conter 600 ml com 400 ml de tampão citrato de sódio e coloque em uma panela de pressão doméstica contendo wat suficienteer para submergir metade do recipiente. Genericamente anexar a tampa da panela de pressão e de calor até à ebulição. Colocar a lâmina cremalheira no tampão de citrato de sódio e fixar firmemente a tampa da panela de pressão. Uma vez pressurizada, deixar ferver durante 3 min. Retire a pressão da panela de pressão e retire o recipiente interior. Permitir lâminas arrefecer no tampão de citrato de sódio durante 10 min à temperatura ambiente. Lavagem das lâminas num banho contendo água purificada durante 5 min. Cercar as seções usando uma caneta barreira hidrofóbica. Lavagem das lâminas por imersão em PBS durante 5 min. O bloqueio da peroxidase endógena e a ligação não específica Incubar secções com 3% de peróxido de hidrogénio diluído em água purificada numa câmara humidificada, durante 30 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O peróxido de hidrogênio é altamente irritante para os olhos, a pele e por ingestão. Utilizar EPI adequado. Toque o excesso de solução de peróxido de hidrogênio e lave SLIdes duas vezes por imersão em solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 2 minutos cada. Incubar secções com imunoglobulina de ratinho a partir do reagente de bloqueio do rato no kit de rato preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Lavagem das lâminas em TBS duas vezes durante 2 minutos cada. A imunodetecção de actina de músculo liso Preparar a solução diluente de anticorpo (fornecido no kit) e incubar com as secções durante 5 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se 1: 100 actina de músculo liso de ratinho anti-humano (Dako M0851) em solução diluente de anticorpo. Diluir controlo de isotipo de IgG2a de ratinho em solução diluente de anticorpo, assegurando que a concentração de imunoglobulina final é equivalente em ambas as soluções. Toque o excesso de seções de solução diluente de anticorpo e cobrir com tanto soluções de controle de anticorpos isotípicos ou diluído. Incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lave as lâminas duas vezes em TBS para2 min cada. Diluir anticorpo anti-ratinho biotinilado secundário e secções incubar durante 10 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções dos fabricantes. Lavagem das lâminas uma vez cada com TBS e PBS durante 2 min, respectivamente. Preparar a solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) de acordo com as instruções do fabricante. Cubra seções com solução DAB e incubar por até 4 min, garantindo para monitorar seções para evitar o excesso de desenvolvimento da cor. CUIDADO: DAB é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Utilizar EPI adequado ao manusear. Imergir as lâminas em água purificada uma vez intensidade da coloração desejada seja atingida. Contracoloração com 50% Gill No. 3 hematoxilina durante 20 segundos e lavar em uma calha de coloração em água corrente até que a água corre claro. Desidratação e montagem Dentro de um exaustor, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo 70% ethanol, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio