마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
eutherian 임신 동안 영양소, 가스 및 노폐물의 교환은 태반에 의해 매개된다. 여성의 생식 기관에서 자궁 동맥 자궁에 혈액의 주요 도관이다. 주입 후, 전문 선박에이 지점 fetoplacental 유닛으로 탈락의 basalis를 통해 코일 나선형 동맥을했다. 직경 특히 자궁 자연 살해 (UNK) 세포, 백혈구에 의해 둘러싸여있다 이러한 나선형 동맥의 탄력성, 태반 1, 2에 볼륨을 사용할 수 혈액의 속도를 지시. 나선형 동맥의 리모델링의 결과로 올바른 혈역학 적 변화는 임신 성공을 위해 중요하다.
기전은 인간과 생쥐 사이 임신 상세히 다르지만, 두 종의 리모델링 과정의 최종 결과는 평활근 층을 잃게 팽창 높은 컨덕턴스 혈관이다. 마우스에서, UNK의 (IF 인터페론 세포 유래N-) γ 주위 중반 임신 3-5에서 이러한 변화를 유도하는 것이 필요하다. NK 세포 또는 IFN-γ의 신호 전달 경로의 구성 요소 중 하나가 결여 된 마우스에서는 이러한 변화를 겪게 못하고 이는 fetoplacental 부에 적절한 혈액 공급의 중요성을 강조하고, 감소 된 태아 성장 -6,7-와 연관된다. 초기 인간 임신 중, 간질 및 혈관 extravillous 영양막 세포의 침략과 UNK 세포와의 상호 작용은 혈관의 변화를 유도하고 태아의 성장 8-10을 촉진하기위한 중요하다. UNK 세포는 과립구 대 식세포와 같은 사이토 카인 및 케모카인 (11)를 통해 인간 영양막 세포 침윤을 조율 할 수있다 – 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 12. 얕은 영양막 세포의 침윤이 같은 자간전증 9 감소 동맥 리모델링과 임신 합병증과 연관되어 있습니다.
이 프로토콜은 중요한을 설명 앤 Croy의 선구적인 작업을 기반으로면역 조직 화학 염색과 우아한 전송 실험 5,13 통해 성공적인 혈관 재에 대한 면역 체계, 특히 북한에서 파생 된 IFN-γ의 역할. 여기에서 우리는 나선형 동맥의 리모델링 상태를 평가하는 빠르고 경제적 인 방법을 설명합니다. 우리 연구실은 정기적으로 중간 임신 (임신 일 (GD) 9.5) 14이 평가되지만, 리모델링 과정은 gd8.5 12.5 (15) 사이에 발생한다. 자동 슬라이드 스캐너의 출현은 크게 섹션에서 용기 루멘 영역의 평가를 촉진하고 우리는이 혈관 직경을 측정보다 더 재현 방법이 될 것을 알았다. SMA의 면역 검출의 추가는 stereological 평가에서 얻은 결과의 직접적인 확인이 가능합니다. 모든 stereological 기술과 같이, 적어도 두 개의 시험관 맹검 실험으로 평가를 수행 할 것을 권장한다. 직렬로 절단 할 때이를 위해 랜덤 단계를 도입 할 수있다팅은 샘플 슬라이드를 평가하는 연구자가 샘플을 제공하는 실험 그룹에서 알고하지 않도록.
이 프로토콜의 전반적인 목적은 신중 임신 관련 합병증의 마우스 모델의 문맥에서 정의 부계 및 모계 유전형을 가진 마우스에서 나선형 동맥의 재 형성을 평가하기 위해 신뢰할 수있는 도구를 제공하는 것이다. 결과는 정상적인 태아 성장에 필수적인이 프로세스의 UNK 세포에 의존을 강조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 성공적인 임신에 필요한 혈관의 변화를 평가함으로써 재현 방법을 제공하도록 설계된다. 이 평가에 필수적인 조직 절편의 품질이다. 모두 정확하게 안정적으로 자궁 동맥 중요한 단계입니다 결찰뿐만 아니라 주입 사이트의 임신 주수를 결정하는 단계를 포함한다. 등의 고정 시간, 조직 처리 프로토콜, 같은 파라미터에서의 변화는 결과에 영향을 미칠 수있다. 바이어스 stereological 평가, 각 이식 장소에서 용기의 동일한 수를 측정하는 것이 중요하다. 그것은 주입 사이트와 세중의 각 주입 사이트 당 5 혈관을 측정하는 것이 좋습니다. 이 15 측정의 평균은 5 최대 규모의 선박의 평균 크기를 나타냅니다.
– / – IL2rg – 또한 alymphoid Rag2의 데이터에 / – 마우스는 여기에 표시된, 우리는이 PROT 발견억제 NK 세포 (14) 중 하나를 포함 불충분 한 산모의 면역 기능의 모델의 숫자에 유용 ocol. 동맥 리모델링에 결함이 또한 장애인 영양막 세포의 침윤 (18)의 모델에 표시되어 있고 여기에 설명 된 기술은 이러한 경우에 혈관을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 최적화 된 마우스의 중간 임신에서 탈락 혈관 재 형성의 조사를 위해이 프로토콜을 검증하지만, 다른 모델 시스템 (예 : 쥐) 또는 다른 기관에서 작동하는이 프로토콜을 적용하는 것도 생각할 수있다. 우리가 북한에 의존 리모델링이 견고 gd9.5에서 평가 될 수 있음을 발견하지만, 이러한 산모의 혈관이 완전히 개조되어 gd12.5, 다른 시점에 대한 개정 될 수있다. 이 시점에서, 혈관 영양막 침입 깊이는 16이며,이 시점은 혈관 변화 영양막의 역할을 조사 더 적합 할 수있다. 추가 양적 판독이 요구되는 경우,조사자는 또한 SMA 스테인드 섹션들의 수를 증가시키고, 각각의 주입 부위에서 부분적으로 개조 된 선박의 백분율을 평가할 수있다.
이 프로토콜의 제한은 조직 학적 검사의 기술적 인 성격이다. 기능 분석은, 그러나, 단지 느리게 (예 도플러 초음파로 19) 가능 해지고있다. 이러한 기술 및 전문 기술을 획득하고 유지하기위한 장치를 더 높은 비용을 필요로하지만, 조직 학적으로 관찰 할 수있는 변화의 효과를 생체 내에서 판독 길이를 제공하는 장점이있다. 모든 stereological 시험의 가능한 단점은 연구자의 주관입니다. 이를 위해, 모든 샘플을 개별적으로 분석하는 두 개의 독립적 인 시험관을 사용하여이 문제를 피하는 것을 도울 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜이 많은 혈액 것을 말하고, 인터페이스에 도달하는 방법에 대한 통찰력을 주지만, 그것은 COMPL 함께 결합하는 것이 유리할 수있다플라스틱을 통해 맥관 구조에서 임의의 주어진 시간에 혈액의 총량을 평가하는 방법은 16 ementary 캐스트.
이 프로토콜의 강도는 두 개의 독립적 인 접근 방식을 결합한 것입니다. 혈관 변화는 제 Stereology를 정량적으로 평가되고, 결과는 다음을 사용하여 면역 조직 화학 질적 검증된다. 결과의 신뢰성을 추가로 샘플을 랜덤으로 강화 될 수있다. 이 프로토콜 작성된 샘플은 쉽게 또한 엄격 midgestation에서 임신 표현형을 평가하기 위해, 이러한 decidualisation 임신 (MLAp) 또는 관심의 세포 면역의 mesometrial 림프 골재의 개발과 같은 임신의 다른 매개 변수를 조사하기 위하여 사용될 수있다.
동맥 리모델링 여성과 이러한 변화의 실패 복잡하지 않은 임신을위한 중요한 단계는 큰 산과 증후군 (GOS), 즉 전자 간증, 태아 성장 제한 및 토대입니다사산. 우리는 신중하게 GOS의 병태 생리의 일부 특성을 모방 마우스 모델에서 임신 표현형을 평가하기 위해 여기에 기술을 제시한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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