Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
De uitwisseling van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen tijdens eutherian zwangerschap wordt gemedieerd door de placenta. In het vrouwelijke voortplantingssysteem, het uterine slagaders zijn de hoofdkanalen van bloed naar de baarmoeder. Na implantatie, deze tak in gespecialiseerde schepen genoemd spiraal slagaders die spoel door de decidua basalis naar de foetoplacentaire unit. Diameter en elasticiteit van deze spiraal arteriën, die worden omgeven door leukocyten, met name baarmoeder natural killer (uNK) cellen dicteren volume en de bloed waarover de placenta 1,2. Correct hemodynamische veranderingen als gevolg van hermodellering van de spiraalvormige arteriën cruciaal zijn voor succes zwangerschap.
Terwijl de onderliggende mechanismen in detail verschillen tussen mensen en muizen zwangerschap, het uiteindelijke resultaat van de verbouwing proces in beide soorten is uitgezet, hoog geleiding vaatstelsel dat de gladde spierlaag verliest. Bij muizen, uNK cel-afgeleid interferon (IFN-) γ moeten deze veranderingen op ongeveer halverwege de dracht 3-5 induceren. Muizen die ofwel NK-cellen of componenten van de IFN-γ signaalroute missen niet aan deze wijzigingen ondergaan en dit wordt geassocieerd met een verminderde foetale groei 6,7, benadrukt het belang van een adequate bloedtoevoer naar de foetoplacentaire unit. Tijdens de vroege zwangerschap bij de mens, de interstitiële en endovasculaire invasie van extravilleuze trofoblast en hun interactie met uNK cellen zijn belangrijk voor het induceren van vasculaire veranderingen en bevordering van groei van de foetus 8-10. uNK cellen kunnen menselijk trofoblastinvasie orkestreren tot 11 chemokines en cytokines zoals granulocyte macrofaag – koloniestimulerende factor (GM-CSF) 12. Ondiepe trofoblastinvasie is geassocieerd met een verminderde arteriële hermodellering en zwangerschap complicaties zoals pre-eclampsie 9.
Dit protocol is gebaseerd op het pionierswerk van Anne Croy die belangrijke omschrevenrol van het immuunsysteem in het bijzonder NK-afgeleide IFN-γ voor succesvolle vasculaire remodeling immunohistochemie en elegant overdrachtsexperimenten 5,13. Hier beschrijven we een snelle en goedkope manier om de verbouwing status van spiraal arteriën beoordelen. Hoewel onze lab beoordeelt deze regelmatig halverwege de dracht (zwangerschap dag (GD) 9.5) 14, de verbouwing proces plaatsvindt tussen gd8.5 en 12,5 15. De komst van geautomatiseerde slide scanners heeft aanzienlijk vergemakkelijkt de beoordeling van het schip en lumen gebieden van secties en we vonden dat dit een meer reproduceerbaar aanpak dan het meten schip diameters zijn. De toevoeging van immunohistochemische detectie van SMA maakt een eenvoudige bevestiging van de resultaten van de stereologische beoordelingsresultaten. Zoals met alle stereologische technieken, is het raadzaam om de beoordeling uit te voeren als een blind experiment door ten minste twee examinatoren. Daartoe kan een randomisatie stap gebeuren, wanneer in serie gesnedenting van de monsters, zodat de onderzoekers de beoordeling van de dia's niet weten uit welke experimentele groep de monsters komen.
De algemene doelstelling van dit protocol is een betrouwbaar hulpmiddel om de herinrichting van spiraal arteriën zorgvuldig te beoordelen in muizen met gedefinieerde moeders en vaders genotypes, in het kader van muismodellen voor zwangerschap-gerelateerde complicaties te bieden. De resultaten benadrukken de afhankelijkheid uNK cellen volgens deze werkwijze, die essentieel is voor normale groei van de foetus.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde protocol is ontworpen om een reproduceerbare methode om de vasculaire veranderingen die nodig zijn voor succesvolle zwangerschap te beoordelen. Kritiek voor het succes van deze evaluatie de kwaliteit van de weefselsecties. Zowel nauwkeurig bepalen van de zwangerschapsduur van de implantatieplaatsen als betrouwbaar ligeren van de baarmoeder slagaders zijn cruciale stappen. Veranderingen in parameters zoals de tijd van fixatie, tissue-processing protocol, etc. kunnen ook het resultaat beïnvloeden. Voor een onbevooroordeelde stereologische beoordeling is het belangrijk om hetzelfde aantal vaartuigen in elke implantatieplaats te meten. Het wordt aanbevolen om 5 schepen per implantatie en elke implantatie in drievoud te meten. Het gemiddelde van deze 15 metingen is de gemiddelde grootte van de 5 grootste vaten.
Naar aanleiding van de gegevens van alymphoid RAG2 – / – IL2rg – / – muizen hier, vonden we dit protocol nuttig voor een aantal modellen van onvoldoende maternale immuunsysteem, waaronder een van geremde NK-cellen 14. Defecten in arteriële hermodellering zijn ook aangetoond in modellen van verminderde trofoblastinvasie 18 en de hier beschreven technieken kan nuttig zijn om de vasculatuur beoordeeld in deze gevallen. We gevalideerd en het protocol voor het onderzoeken van deciduale vasculaire remodellering halverwege de zwangerschap in muizen, maar het is ook denkbaar om dit protocol passen om te werken in andere modelsystemen (bijvoorbeeld ratten) of in andere organen. Hoewel we vinden dat de NK-afhankelijke remodeling robuust kan worden beoordeeld op gd9.5 kan worden aangepast voor andere tijdstippen zoals gd12.5, wanneer de maternale vasculatuur volledig vernieuwd. Op dit tijdstip, endovasculaire trofoblastinvasie dieper 16 en dit tijdstip kan geschikter voor onderzoeken van de rol van trofoblast voor vasculaire veranderingen. Als aanvullende kwantitatieve uitlezingen gewenst,onderzoekers kan ook verhoging van het aantal secties gekleurd voor SMA en beoordeelt het percentage gedeeltelijk gerenoveerd schepen binnen elke implantatie.
Een beperking van dit protocol is het beschrijvend karakter van histologische onderzoeken. Functionele assays worden echter slechts langzaam beschikbaar komen (bijvoorbeeld Doppler 19). Deze technieken vereisen technische expertise en veel hogere kosten van aanschaf en het onderhoud materiaal, maar hebben het voordeel dat een longitudinale in vivo uitlezing voor het effect van de veranderingen die histologisch kunnen worden waargenomen. Een mogelijk nadeel van alle stereologische examens is de subjectiviteit van de onderzoekers. Daartoe waarbij twee onafhankelijke onderzoekers dat alle monsters zelfstandig verwerken kan helpen om dit probleem te vermijden. Terwijl de hier geschetste protocol geeft inzicht in hoeveel bloed het fetomaternal interface kan bereiken, kan het voordelig zijn te combineren met de compl wordenementary benadering van de beoordeling van de totale hoeveelheid bloed op elk moment in de vasculatuur door plastische werpt 16.
De sterkte van dit protocol is dat het twee onafhankelijke benaderingen. Vasculaire veranderingen wordt eerst kwantitatief beoordeeld door stereologie en het resultaat wordt vervolgens kwalitatief gevalideerd middels immunohistochemie. De betrouwbaarheid van de resultaten kan verder worden versterkt door randomizing de monsters. De voorbereid protocol monsters kan gemakkelijk worden ook onderzocht andere parameters van de zwangerschap als decidualisatie, ontwikkeling van de mesometrial lymfoïde aggregaat zwangerschap (MLAp) of immunodetectie van cellen van belang, om een zwangerschap fenotype streng beoordeeld op midgestation.
Arteriële remodeling is een cruciale stap voor de ongecompliceerde zwangerschappen bij vrouwen en het falen van deze veranderingen ten grondslag ligt aan de grote verloskundige syndromen (GOS), namelijk pre-eclampsie, foetale groei beperking endoodgeboorte. Wij presenteren hier technieken om een zwangerschap fenotype in muismodellen die enkele kenmerken van de pathofysiologie van GOS nabootsen zorgvuldig te beoordelen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
