同時2光子<em>インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの>イメージング
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
二光子顕微鏡は、生きている動物を振る舞うで脳活動の観察に革命をもたらしました。 1990年に導入されて以来、それはすぐに人気を博し、現在は生体内 1,2 における脳活動の多くの側面の検討に向けた最も興味深く、革新的なアプローチの一つとして実装されています。これらのアプリケーションは、（ 例えば 、カルシウムレベルのインジケータまたは即時初期遺伝子の発現を使用して）ニューロンの活性化を血流測定を含み、神経細胞の形態。研究室の増加数は、in vivo脳イメージングのための新しい標準として科学の世界全体の技術を実装し、2光子顕微鏡を使用しています。
標準的なアプローチは、マウス脳3のバレルまたは視覚皮質の上に頭蓋窓（カバーガラスで覆われた頭蓋内の丸い穴）の移植を必要とします。次に、実験プロトコルに応じて、畝SEは、時間4,5を介して脳の活動と神経細胞の形態の変化を監視することができ、可視化と行動訓練の一連のセッションを受けます。両方の場合において、開頭術は縫合糸を交差させず、頭頂骨に影響を与えます。主に技術の主な欠点は、バレルまたは視覚野など簡単にアクセス皮質への限られたアプリケーションであると考えられています。他の地域以上の頭蓋窓の移植は、過度の出血および/または空間的障害のために、多くの困難をもたらします。
本論文では、 生体顕微鏡 6 の 2光子のための目的の別の可能な領域として脳梁膨大後部皮質（RSC）上記の頭蓋窓の移植を提案します。 RSCは、空間記憶の形成に関与する脳回路の重要な要素です。解剖学的に、RSCは、皮質、海馬、および視床領域7を接続する神経ネットワークの一部です。それはそのような空間学習や絶滅だけでなく、空間ナビゲーション6として振る舞い、の範囲で深く関わっ。
我々は、THY1プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックマウス系統を使用し、ニューロンの形態学的変化を視覚化するためです。これらのマウスでは、GFPは、二光子顕微鏡法8を用いて、皮質の軸索と樹状突起の明確な可視化を可能にする脳内のニューロンの約10％で発現されます。我々が提案するもう1つの技術革新は、RSCに突出した脳のより深い構造にニューロン特異的CaMKIIのプロモーター 9の下に赤色蛍光タンパク質（mCherryを）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス血清型2/1（rAAV2を/ 1）の注射であります、海馬など。 Thy1-GFPマウスの海馬におけるrAAV2を/ 1 mCherryをの発現がhippocampo-corticaの前およびシナプス後要素の同時可視化を可能にしますlは10をシナプス。 mCherryをののrAAV駆動発現は、軸索の端末で十分なレベルに到達するために、タンパク質のための2〜3週間を必要とします。この期間は、開頭手術からの回復のために必要な通常の時間と一致しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在の論文では、頭蓋窓からRSCにおけるシナプス入力とシナプス後ターゲットのin vivoイメージングでの同時2光子のためのプロトコルを提示します。移植手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、動物が深く麻酔し、定位フレームに固定され、その後、RSC以上の頭蓋骨は、マークされた円形の線に沿ってドリルと円形の骨が除去されて薄くされます。出血?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、撮影の支援のための音声録音、図面のためのM. Borczyk、ウイルス産生のためのA.Trąbczyńska、遺伝子型決定のためのM.ZiókowskaとA. MirgosのためのM. Steczkowskiに感謝したいと思います。 KRはK. DeisserothからのCaMKプロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryをを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の寄贈を認めています。このプロジェクトは、欧州連合（EU）によって賄わCEPTインフラストラクチャを使用して、組織の構造と機能、神経生物学、実験生物学のNencki研究所のセンターの動物モデルおよび研究室の研究室の中核施設で行われた – 欧州地域開発基金の中を2007-2013のためのオペレーションプログラム「革新的な経済」。この作品は、国立科学センターからの助成金によってサポートされていました：ソナタビス2012/05 / E / NZ4 / 02996、ハルモニア2013/08 / M / NZ3 / 00861、Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 KRとソナタビス2014年に/ 14 / E / NZ4 / 00172 RCへ
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
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