Summary

שני פוטונים סימולטני<em> In vivo</em> הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

Published: March 13, 2016
doi:

Summary

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Abstract

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.

The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.

The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.

This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Introduction

שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo.

הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלון גולגולתי (חור עגול הגולגולת מכוסית זכוכית לכסות) מעל החבית או בקליפת המוח הראייתית של עכבר המוח 3. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הניסוי, mouse עובר סדרה של ויזואליזציה והדרכות התנהגותי, המאפשר לעקוב אחר השינויים בפעילות המוח והמורפולוגיה עצבית לאורך זמן 4,5. בשני המקרים craniotomy משפיע רק על עצם הקודקוד, מבלי לחצות את התפרים. הוא האמין בעיקר כי החיסרון העיקרי של השיטה הוא היישום שלה מוגבל cortexes ונגיש כגון חבית או בקליפת המוח הראייתית. השרשה של החלון גולגולתי על פני אזורים אחרים מציבה הרבה קשיים, עקב דימום יתר ו / או הפרעה מרחבית.

במאמר זה אנו מציעים את ההשתלה של החלון גולגולתי מעל הקורטקס retrosplenial (RSC) כעוד באזור ריבית אפשרי עבור שני פוטונים in vivo מיקרוסקופיה 6. RSC היא מרכיב חשוב של המעגל במוח האחראי על היווצרות הזיכרון המרחבי. אנטומית, RSC היא חלק מהרשת עצבית חיבור קליפת מוח, בהיפוקמפוס, ואזורים התלמוס 7. זהבכבדות מעורב במגוון של התנהגויות, כגון לימוד ושינון הכחדה המרחבית וכן ניווט מרחבית 6.

על מנת להמחיש את השינויים המורפולוגיים של נוירונים אנו משתמשים קו עכבר מהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן Thy1. בעכברים אלו, GFP מתבטא כ 10% של הנוירונים במוח המאפשרים להדמיה ברורה של אקסונים קליפת המוח דנדריטים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים 8. חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקה של סרוטיפ וירוס adeno הקשורים רקומביננטי 2/1 (מרמת rAAV2 / 1) קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום (mCherry) תחת האמרגן camkii ספציפי נוירון 9 לתוך המבנים העמוקים יותר של המוח מקרין RSC , כגון ההיפוקמפוס. הביטוי של מרמת rAAV2 / 1 mCherry בהיפוקמפוס של העכבר Thy1-GFP מאפשר להדמיה סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic של hippocampo-cortical הסינפסות 10. הביטוי rAAV מונחה של mCherry דורש שבועיים עד שלושה שבועות לחלבון להגיע לרמה מספקת במסופים אקסונלית. תקופה זו עולה בקנה אחד עם הזמן הרגיל הנדרש להתאוששות מן craniotomy.

Protocol

כל הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון Nencki לביולוגיה ניסויית, פולנית האקדמיה הלאומית למדעים. הערה: החלק מן הקלעים של הווידאו הקשור מואץ. גורם מהירות מותווה בסצנות אלה. <p class="jove_title" style=";text-align:right;direction…

Representative Results

הביטוי של ה- GFP משנה של נוירונים עכבר כתב Thy1-GFP מאפשר in vivo ההדמיה של דנדריטים קליפת המוח ותחזיות axonal המקומיות RSC. איור 1 א מציג הקרנה מקסימלי של ערימה של תמונות עם דנדריטים GFP חיובים מרובים גלויים. גוף התא הוא מוסתר על ידי עורק. 1B האי…

Discussion

במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי – קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית "כלכלה חדשנית" עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00,691 ל KR וסונטה Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Materials

Drug
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 5-2% pre-operative
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 1.5-2% during surgery
Dexametasone Scan Vet Dexasone 2mg/ml 0.2 mg/kg intramuscular
Baytril Bayer 2.50% 5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine Vetoquinol 4% 4 mg/kg subcutaneously
Butomidor Richter Pharma 10 mg/ml 2 mg/kg subcutaneously
Carprofen KRKA-Polska Rycarfa 50mg/ml 10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine Jelfa Lignocainum topically
Lidocaine Jelfa 20 mg/g topically
Surgery
Gelfoam Ethicon Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment Dedra Lubrithal topically
CA glue Pelikan Daniel 20G Huste
Dental acrylic SpofaDental Duracryl Plus
Stereotaxic frame Stoelting 51500D
Tool
Coverglass Harvard Apparatus HSE-64-0720 3 mm diameter
Dental drill Sigmed Keystone KVet
Fixation bar Custom made N/A M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps Renex PN-7B-SA
Micro scissors Falcon BM.183.180
Dissection microscope KOZO XTL6445T
Imaging
Holder frame Custom made N/A
Two-photon microscope Zeiss Upright Axio Examiner Z1 Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. 
Reagent
Virus gift from K. Deisseroth Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter

References

  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  3. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
  5. Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
  6. Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
  7. Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
  8. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  9. Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
  10. Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).

Play Video

Cite This Article
Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł., Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex. J. Vis. Exp. (109), e53528, doi:10.3791/53528 (2016).

View Video