Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Imunofenotipagem do sangue periférico por fluxo determina citometria de mudanças no status de leucócitos periféricos frequência e activação durante a doença e tratamento. Tem o potencial para prever a eficácia terapêutica e identificar novos alvos terapêuticos. coloração de sangue total utiliza sangue não manipulada, o que minimiza artefactos que podem ocorrer durante a preparação da amostra. No entanto, a coloração sangue total deve também ser feito sobre o sangue colhido de fresco para garantir a integridade da amostra. Além disso, é melhor se preparar cocktails de anticorpos no mesmo dia, para evitar potenciais instabilidade do tandem, corantes e evitar a interação reagente entre corantes violeta brilhante. Portanto, a coloração de sangue total requer cuidadosa padronização para controlar a variabilidade intra e inter-experimental.
Aqui, nós relatamos a implantação de um manipulador de líquidos automatizado equipado com um bidimensional (2D) leitor de código de barras em um processo padrão de fazer Antibodcocktails y para citometria de fluxo. Os anticorpos foram transferidos para tubos de código de barras 2D arranjados num formato de 96 poços e os seus conteúdos compilados numa base de dados. O manipulador de líquido pode então localizar os frascos de anticorpos fonte referenciando nomes de anticorpos dentro do banco de dados. O nosso método eliminado coordenação entediante para o posicionamento dos tubos de anticorpos de origem. Forneceu versatilidade permitindo que o usuário altere facilmente qualquer número de detalhes no processo de distribuição de anticorpo, tal como um anticorpo específico para usar, volume e destino, modificando o banco de dados sem reescrever o script no método de software para cada ensaio.
A prova de conceito experimento alcançado notável precisão do ensaio inter e intra, demonstrado pela preparação réplica de um 11-cor, fluxo de 17 anticorpo citometria de ensaio. Estas metodologias maior rendimento global de citometria de fluxo ensaios e facilitou a preparação diária dos cocktails de anticorpos complexos necessários para a pheno detalhadacaracterização typic de sangue periférico anticoagulado de colheita recente.
Introduction
Imunofenotipagem do sangue periférico humano determina alterações quantitativas e qualitativas em subconjuntos de células imunitárias 1. Ele fornece insights sobre os mecanismos de ação e resistência, descoberta ajudas de biomarcadores preditivos, e facilita o desenvolvimento de imunoterapias combinação. Portanto, a validação e padronização de imunofenotipagem é uma área de grande interesse para pesquisadores acadêmicos, laboratórios clínicos, e indústrias.
Embora imunofenotipagem do sangue periférico por métodos de citometria de fluxo é usado atualmente para o manejo clínico de doenças malignas hematológicas 2,3 e vírus da imunodeficiência humana (VIH) 4,5, imunofenotipagem confiável de sangue periférico para as demandas de imunoterapia considerações específicas na validação e padronização porque requer mais extensa cobertura sobre subconjuntos de células imunes e ativação de receptores inibitórios / 1,6-8. succeimunofenotipagem ssful exige padronização cuidadosa para minimizar a variabilidade experimento-a-experimento relacionado à configuração do instrumento e do processo de coloração de células 9,10. Enquanto padronização das definições do aparelho para citometria de fluxo está bem estabelecido para resolver o ex preocupação 9,11,12, não se sabe como para minimizar a variabilidade relacionada com coloração celular sem restringir a cobertura de subconjuntos de células imunes e seu estado de ativação.
À medida que o número de antigénios a serem detectados aumenta, o mesmo acontece com a oportunidade de erro e a variabilidade devido à distribuição do reagente sub-óptima e a contaminação cruzada. Métodos de análise phenoptypic de sangue total anticoagulado foram estabelecidas na década de 1980 atrasado para utilização em ensaios de laboratório clínico. Estes mesmos métodos servir as necessidades do laboratório de pesquisa para preparação de amostras. Importante, as misturas de anticorpos utilizados nos laboratórios clínicos são tipicamente menos complexo e Available pré-titulado e pré-misturado a partir do fabricante. Apenas uma única transferência do cocktail de anticorpos pré-misturado é necessária. No contexto de investigação, misturas de anticorpos de anticorpos 10-16 são típicos. Cada cocktail deve ser validado para a estabilidade pelo laboratório ou preparada antes de cada ensaio. Preparando vários cocktails de anticorpos para uma amostra possam implicar a pipetagem de 50-80 anticorpos individuais, uma tarefa que é tediosa e propensa a erros.
Automatização de preparação de cocktail tem várias vantagens sobre a preparação cocktail manual de como menos erros, maior precisão de pipetagem, e possivelmente até mesmo diminuiu o desperdício de reagente. Aqui, nós relatamos a introdução bem sucedida de um manipulador de líquidos automatizado equipado com um bidimensional (2D) leitor de código de barras para o processo de coloração de células da imunofenotipagem para minimizar a variabilidade relacionada com a preparação da amostra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imunofenotipagem de sangue periférico é criticamente importante para a obtenção de insights sobre as respostas individuais à imunoterapia. O desafio reside na normalização ensaio para controlar a variabilidade 1,14 experimento-a-experiência. Uma fonte principal de variabilidade reside na manipulação humana de amostras. Portanto, é concebível que a automatização completa ou parcial do processamento da amostra irá facilitar uma redução dramática na variabilidade 1,14 experimento-a-experimento. Neste protocolo, relatamos o nosso bem-sucedido esforço para minimizar a variabilidade do ensaio através da introdução de um manipulador de líquidos automatizado equipado com leitor de código de barras 2D para a coloração da amostra total imunofenotipagem sangue.
No design, o nosso método é versátil e pode monitorar outros subconjuntos imunes, acrescentando adicionais "Cocktails base" para defini-los. Tais subgrupos incluem células T auxiliares, células T reguladoras, células B, células NK, células dendríticas e monócitos (manuscrito empreparação) 18. Nós adaptamos painéis de anticorpos recomendados pelo consórcio através da introdução de marcadores adicionais 1. populações celulares foram identificados utilizando "cocktail Base" conjugados com fluorocromos com emissões mínimas para o brilhante violeta 421 (BV421), ficoeritrina (PE), e aloficocianina (APC) detectores, como queríamos para reservar estes canais para a detecção de antigénios induzíveis. Esta característica não só garante a mais alta sensibilidade para monitorar o status de ativação de células imunes, mas também permite acomodação flexível de novos marcadores de ativação, como estes três fluorocromos são mais frequentemente conjugada com anticorpos contra marcadores induzíveis. Por isso, o nosso método não só é adequado para a preparação de cocktail para toda a imunofenotipagem de sangue, mas também é útil para a coloração de outras amostras, incluindo células mononucleares de sangue periférico e as células recuperadas a partir de tecidos de desagregação (por exemplo, tumor).
introdução bem sucedidadução do nosso método requer uma atenção especial aos passos na preparação laboratorial e de programação e execução do método. Preparação dos tubos de código de barras 2D inclui rotulagem com rótulos legíveis por humanos e transferência dos anticorpos aos tubos designados. Para evitar a introdução de erros, recomendamos fazer isso com duas pessoas. Sempre mudando planilhas, os investigadores devem verificar se o método funciona corretamente. Escolher métodos de pipetagem adequadas durante a programação garante a transferência líquida de sucesso. LLS permite pipetagem sem receber detritos precipitou a partir do fundo de tubos de anticorpos, para o qual usamos tanto P50 ou P200 dicas condutores. LLS pode não ser uma boa opção para dicas P1000 como LLS é mais sensível com dicas P1000 e às vezes falsamente desencadeada pela presença de bolhas. Heights em definição material de laboratório deve ser ajustada para cada instrumento de transferência de líquido como sub-óptima poderia ocorrer, por exemplo, se não houver espaço suficiente entre a borda de dicase a parte inferior de tubos. Como mostrado na Figura 12, se o "cocktail Base" e / ou "cocktail Activação" não são bem agitadas, pode resultar em sub-óptima de coloração.
Nós pensamos sobre o uso de reagentes liofilizados para a coloração de células como uma abordagem alternativa para reduzir a variabilidade relacionada com o reagente de distribuição 19. No entanto, os conjugados de polímero de corantes violeta brilhante são conhecidos por interagir uns com os outros que provoquem sinais não específicos. Como tal, a adição de mais do que dois conjugados de polímero (por exemplo, BV421 e BV650 etc.) em reagentes liof ilizados podem causar sinalização não-específica (por exemplo, aumento do sinal de fundo no BV650 BV421 + população) 20. Além disso, reagentes liofilizados carecem de flexibilidade para a inclusão de nova coloração. Eles são geralmente mais caros e exigem uma ordem de maioria. Por essas razões, optamos por utilizar o manipulador de líquidos automatizado equipado com tubos de código de barras 2D. Embora tflocos tempo para configurar e implica um investimento inicial para comprar o instrumento, no longo prazo, tais fatores serão compensadas pelo aumento da produtividade e reprodutibilidade dos ensaios. Na verdade, alguns grupos previamente relatado a integração bem sucedida do manipulador de líquidos automatizado em seu fluxo de trabalho de imunofenotipagem ou aplicações semelhantes 21,22. soluções automatizadas para análise de citometria de fluxo também estão disponíveis a partir de fontes comerciais (FACS SPA III, Cocktail Automated Preparação de estação de trabalho, e FlowStainer). Isto indica ainda existe uma grande necessidade de uma preparação de cocktail automatizado para imunofenotipagem.
Depois de dominar esta técnica, nós prevemos que o desenvolvimento de totalmente automatizado imunofenotipagem sangue total irá reduzir ainda mais variabilidade experimento-a-experiência e pode fazer toda a imunofenotipagem do sangue viável, mesmo em um ensaio clínico multicêntrico ajuste 23. Nós já começaram usando uma lise foih assistente para automatizar os passos de lise e de lavagem. Nós também prevêem que a determinação automatizada do volume de anticorpo nos tubos de código de barras 2D e o acompanhamento de distribuição do reagente melhorará grandemente inventário de anticorpos e o controlo de qualidade sobre o nosso método, respectivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
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