نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
المناعي من الدم المحيطي من قبل التدفق الخلوي يحدد التغيرات في الوضع تردد وتفعيل الكريات البيض الطرفية أثناء المرض والعلاج. لديه القدرة على التنبؤ الكفاءة العلاجية وتحديد أهداف علاجية جديدة. كله تلطيخ الدم يستخدم الدم unmanipulated، مما يقلل القطع الأثرية التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ومع ذلك، يجب أيضا أن يتم ذلك كله تلطيخ الدم على الدم التي تم جمعها حديثا لضمان سلامة العينة. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأفضل لتحضير الكوكتيل الأجسام المضادة في نفس اليوم لتجنب عدم الاستقرار المحتمل للترادف، صبغ ومنع التفاعل كاشف بين الأصباغ البنفسجي رائعة. لذلك، كله تلطيخ الدم يتطلب توحيد دقيق للسيطرة على تقلب داخل وبين التجريبية.
هنا، نحن تقرير نشر معالج السائل الآلي مجهزة ثنائي الأبعاد (2D) قارئ الباركود في عملية موحدة لجعل antibodالكوكتيلات ص لالتدفق الخلوي. تم نقل الأجسام المضادة في 2D أنابيب barcoded مرتبة في شكل 96 جيدا ومحتوياتها جمعها في قاعدة بيانات. معالج السائل ويمكن بعد تحديد موقع قارورة مصدر الأجسام المضادة من قبل المراجع أسماء الأجسام المضادة داخل قاعدة البيانات. القضاء على أسلوبنا التنسيق شاقة لتحديد المواقع أنابيب مصدر الأجسام المضادة. وقدمت براعة مما يتيح للمستخدم بسهولة تغيير أي عدد من التفاصيل في عملية الاستغناء عن الأجسام المضادة مثل الأجسام المضادة المحددة لاستخدام، وحجم، والوجهة عن طريق تعديل قاعدة البيانات دون إعادة كتابة البرمجة في طريقة برنامج لكل فحص.
والذي يدل على التجربة مفهوم تحقيق العالقة بين والبينية دقة الفحص، ويتجلى ذلك إعداد تكرار من 11 لونا، وتدفق 17-الأجسام المضادة الخلوي الفحص. وزادت هذه المنهجيات الإنتاجية الإجمالية لالتدفق الخلوي المقايسات وسهلت إعداد اليومي للالكوكتيلات الأجسام المضادة المعقدة اللازمة لpheno مفصلتوصيف مثال او نموذج من الدم المحيطي anticoagulated جمعت حديثا.
Introduction
المناعي من الدم المحيطي البشري يحدد التغيرات الكمية والنوعية في مجموعات فرعية الخلايا المناعية 1. أنه يوفر نظرة ثاقبة آليات العمل والمقاومة، واكتشاف الوسائل المؤشرات الحيوية التنبؤية، ويسهل تطوير المناعية الجمع. ولذلك، فإن التحقق من صحة وتوحيد المناعي هو مجال اهتمام كبير الباحثين الأكاديميين، المختبرات الطبية، والصناعات.
على الرغم من أن يستخدم المناعي من الدم المحيطي بالطرق cytometric تدفق حاليا لإدارة السريرية من الأورام الخبيثة الدموية 2،3 وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) عدوى 4،5، المناعي موثوق بها من الدم المحيطي للمطالب المناعي اعتبارات محددة في التحقق من صحة وتوحيد لأنه يتطلب المزيد من التغطية واسعة على مجموعات فرعية الخلايا المناعية وتفعيل / المستقبلات المثبطة 1،6-8. SUCCEالمناعي ssful يتطلب توحيد الدقيق للحد من تقلب التجربة إلى التجربة ذات الصلة لإعداد الصك والخلية تلطيخ إجراء 9،10. في حين توحيد إعدادات أداة لالتدفق الخلوي راسخة لمعالجة القلق السابق 9،11،12، فإنه لا يزال من غير الواضح كيفية تقليل التباين المتعلقة تلطيخ الخلايا دون تقييد تغطية مجموعات فرعية الخلايا المناعية وحالة تفعيلها.
ولما كان عدد من المستضدات ليتم الكشف عن الزيادات، فكذلك لا فرصة للخطأ وتقلب نظرا لصرفها كاشف الأمثل والتلوث. تم إنشاء طرق تحليل phenoptypic من الدم الكامل anticoagulated في أواخر عام 1980 لاستخدامها في فحوصات المخبرية السريرية. هذه الأساليب نفسها تخدم احتياجات مختبرات البحوث لإعداد العينة. الأهم من ذلك، الكوكتيلات الأجسام المضادة المستخدمة في المختبرات الطبية وعادة ما تكون أقل تعقيدا وافاilable قبل titered وقبل مختلطة من الشركة المصنعة. مطلوب فقط نقل واحد من كوكتيل الضد قبل مختلطة. في إعداد البحوث، والكوكتيلات الضد من 10-16 الأجسام المضادة هي نموذجية. يجب التحقق من صحة كل كوكتيل للاستقرار من قبل المختبر أو إعداد جديدة قبل كل فحص. إعداد عدة زجاجات الأجسام المضادة لعينة قد يترتب على pipetting لمن 50-80 الأجسام المضادة الفردية، وهي مهمة في آن معا مملة وعرضة للخطأ.
أتمتة إعداد كوكتيل لديه العديد من المزايا إعداد كوكتيل اليدوي مثل أخطاء أقل، وزيادة دقة pipetting ل، وربما حتى انخفاض الفاقد كاشف. هنا، نحن تقرير تطبيق ناجح للمعالج السائل الآلي مجهزة ثنائي الأبعاد (2D) قارئ الباركود في عملية الخلية تلطيخ المناعي للحد من تقلب المتعلقة تحضير العينة.
Protocol
وقد وافق جمع واستخدام الدم المحيطي في هذا البروتوكول من قبل الصحة بروفيدانس والخدمات المؤسسية مجلس المراجعة. وقدمت جميع المواد البشرية المستنيرة المكتوبة. ملاحظة: اتبع الاحتياطات العالمية. ينبغي أن يعامل كل دم الإنسان كما لو المعدية والتعامل معها وفقا للممارسات السلامة الأحيائية المستوى 2. ملاحظة: المناعي مع الدم الكامل المحيطي يتم تنفيذ التي يحتضنها anticoagulated الدم الكامل مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الفلورسنت الموسومة للكشف عن مستضدات سطح الخلية، تليها تحلل منخفض التوتر لإزالة خلايا الدم الحمراء. يتم غسلها الخلايا ويتم تحليل عينة من الكريات التدفق. الطريقة الموصوفة هنا يركز على إعداد خليط الأجسام المضادة باستخدام معالج السائل الآلي مجهزة قارئ الباركود 2D. أولا، "كوكتيل قاعدة" أن يحدد مجموعات فرعية الخلايا المناعية و"كوكتيل تفعيل" التي تراقب طتعد المضادات nducible بشكل منفصل (الجدول 1). ثم يتم خلط كل من الكوكتيلات لإنشاء "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". انظر الشكل 1 لسير العمل. 1. عينة جمع الدم المحيطي عبر بزل الوريد في الهيبارين الصوديوم أنبوب anticoagulated جمع الدم، عكس بلطف عدة مرات لضمان خلط الصحيح، ثم اضغط على RT. رفض العينة إذا متخدر أو hemolyzed 13. 2. إعداد المختبرات الطبية التسمية 2D أنابيب الباركود مع تسميات الإنسان قابل للقراءة (اسم الأجسام المضادة، VENDER، رقم الكتالوج، والكثير عدد). نقل المحتوى بأكمله من قارورة الضد من VENDER (المدرجة في الجدول 1) إلى المقابلة أنابيب الباركود 2D. ملاحظة: خذ الحذر الشديد لعدم إدخال فقاعات فقاعات زورا يؤدي الاستشعار عن مستوى السائل (LLS) التي تؤدي إلى نقل الأمثل للكاشف. ملاحظة: تأكد من أن كل الأجسام المضادة السادسآل ديه أجسام مضادة كافية لتشغيل. قراءة الباركود 2D لكل أنبوب من قبل قارئ الباركود 2D. جعل جدول الذي يحتوي على أسماء الأجسام المضادة (AB) ويقرأ الباركود (قبل الميلاد) باستخدام برنامج جداول البيانات وحفظه في قيم مفصولة بفاصلة (CSV) ملف باسم "AB_BC.csv" (الجدول 2). ملاحظة: تأكد من تنسيق الخلايا كما "نص" وليس "عدد" من اجل الحفاظ على أول "0" أرقام الباركود إن وجدت (على سبيل المثال، 0163562544). إضافة "س، 0000000000" في نهاية لتحديد نهاية من البيانات. لوحات معدنية المسمار LLS إلى الإطار من سطح السفينة في يدوي السائل الآلي لتمكين LLS. 3. البرمجة لالآلي السائل معالج ملاحظة: سيتم برمجتها طريقتين في البرنامج لمعالج السائل الآلي: أ) طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط" في 3.1)، وب) طريقة لجعل "ماستر Antiboكوكتيل دى "من خلال الجمع بين" كوكتيل قاعدة "و" كوكتيل التنشيط "في 3.2) (الشكل 1). إنشاء طريقة لجعل "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل تفعيل" (الشكل 2). باستخدام برنامج جداول البيانات، وجعل البيانات التي لديها معلومات عن أسماء الأجسام المضادة (AB_NAME)، أنبوب جهة المكان (وأيضا قاعدة أو جيدا-ACT)، وحجم (VOL) في ميكرولتر ل "كوكتيل قاعدة" مع نصائح P50 (BASE_CT_P50: الجدول 3) أو نصائح P200 (BASE_CT_P200: الجدول 4) و "كوكتيل التنشيط" مع نصائح P50 (ACT_CT_P50: الجدول 5) أو نصائح P200 (ACT_CT_P200: الجدول رقم 6). حفظها كملفات CSV. ل "جيدا قاعدة" و "حسنا-ACT" المكان، والرجوع إلى الأرقام في الشكل (3). ملاحظة: VOL = عيار س (# من تلطيخ + 2) ميكرولتر. التتر في الجدول 1 هي محددة الكثير. يجب أن المشغل تحديد حلمة الثديإيه لكل الأجسام المضادة كما هو موضح من قبل الآخرين 14. فوق رمز لإطلاق برنامج لمعالج السائل الآلي على الكمبيوتر لخلق طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.3-3.1.7 ستحدد المختبرات: رف أنبوب مع أنابيب 2D الباركود (الشكل 4). يتم توفير القياسات كمرجع. يجب أن المحققين تحديد وضبط لكل أداة. في شريط الأدوات في إطار "المشروع"، حدد "ابوار نوع المحرر". انقر بزر الماوس الأيمن على كائن لوحة مسطحة جيدا 96، حدد "نسخ" واكتب "Matrix_OneML_TubeRack" في نافذة منبثقة. انقر نقرا مزدوجا فوق على الكائن "Matrix_OneML_TubeRack" لفتح مربع الحوار. تسليط الضوء على "معلومات أساسية"، تعيين 12.775 سم (X) و8.546 سم (Y) ل "سبان" و4.625 سم ل "الطول". الشكل (4A). بعد ذلك، تسليط الضوء على "Movemمعلومات الأنف والحنجرة ". يعوض تعيين القابض 0 (X)، 0 (Y)، و 0.3 (Z)، القابض ضغط -0.1cm، القابض Unsqueeze 2.6 سم، الحد الأقصى للسرعة 75٪، ومن ثم تحقق" استخدام أجهزة الاستشعار القابض "(الشكل 4B). ثم، تسليط الضوء على "Well_1". تعيين على النحو التالي: "حسنا أوفست". 1.5 سم (X) و1.13 سم (ص): "حسنا عد". 12 (X) و 8 (ص): "حسنا تباعد". 0.9 (X) و 0.9 (Y)، "حجم الحد الأقصى". 1500 ميكرولتر، تنسيق "، منتظم،" كولوم 2 أوفست "، 0، و" وحدة التخزين الافتراضي "؛ 0 (الشكل 4C). أخيرا، اضغط على "تحرير …" زر على يمين "تكوين حسنا" (الشكل 4C). في النافذة المنبثقة، على النحو التالي: "الشكل". جولة "العليا الشعاع". 0.37 سم، "الشعاع السفلى". 0.37 سم، و "الطول". 3.9 سم. تحقق "القسم أسفل" وتعيين "الشكل". مخروط، "الشعاع". 0.37 سم، و "الطول". 0.4 سم (الشكل 4D). ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.8-3.1.11 وتحديد المختبرات: رف أنبوب مع أنابيب microfuge. يتم توفير القياسات كمرجع. يجب أن المحققين تحديد وضبط لكل أداة. في شريط الأدوات في إطار "المشروع"، حدد "ابوار نوع المحرر". انقر بزر الماوس الأيمن على كائن لرف 24 موقف، حدد "نسخ" ونوع "SmallTuberack_microfugetubes". انقر نقرا مزدوجا فوق على "SmallTuberack_microfugetubes" وجوه لفتح مربع الحوار. تسليط الضوء على "معلومات أساسية"، تعيين 12.75 سم (X) و 8.5 سم (Y) ل "سبان" و 3.95 سم ل "الطول". بعد ذلك، تسليط الضوء على "Well_1". تعيين على النحو التالي: "حسنا أوفست". 1.621 سم (X) و1.181 سم (ص): "حسنا عد". 6 (X) و 4 (ص): "حسنا تباعد". 1.9 (X) و 1.9 (Y)، "حجم الحد الأقصى". 1000 ميكرولتر، تنسيق "، منتظم،" كولوم 2 أوفست "، 0، و" وحدة التخزين الافتراضي ". 0. أخيرا، اضغط علىو"تحرير …" زر على يمين "تكوين حسنا". في النافذة المنبثقة، على النحو التالي: "الشكل". جولة "العليا الشعاع". 0،3345 سم، "الشعاع السفلى". 0.274 سم، و "الطول". 3،6728 سم. تحقق "القسم أسفل" وتعيين "الشكل". نصف الكرة الأرضية، و "الشعاع". 0،1575 سم. ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.12-3.1.35 سوف يشرح كيفية برمجة "طريقة جديدة" لجعل "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل تفعيل" (الشكل 2). انقر على "طريقة جديدة" رمز ومفتوحة. سحب "IF" رمز بين "ابدأ" ورمز "إنهاء" في طريقة جديدة (الشكل 2). انقر وتسليط الضوء على "IF" رمز. اكتب ما يلي الحالة: CREATEOBJECT ( "World.EngineObject") محاكاة ملاحظة: هذا سوف يمنع البرنامج من أداء والتحقق من الخطأ وتمكين هذه الطريقة في العمل. من دون هذه الخطوة، لياليoftware سينبه المعلومات الناقصة للبيانات كما يقرأ الباركود لا تتوفر إلا بعد الخطوة "VisionMate: قراءة الباركود" الموصوفة في 3.1.20). منذ هذه الخطوة تعطيل خطوة التحقق في البرنامج، يجب أن المشغل تأكيد هناك ما يكفي من النصائح وكاشف على سطح السفينة لتنفيذ هذا الأسلوب. إدراج رمز "إعداد الصك" بين "ثم" رمز وأول رمز "نهاية" تحت عنوان "IF" أيقونة (الشكل 2). ملاحظة: للحصول على كافة الخطوات التالية، والرموز السحب بين رمز "آخر" والثاني "إنهاء" رمز تحت عنوان "IF" رمز بحيث يتم تغليف الخطوات في "شيء آخر". سحب "إعداد الصك" رمز تحت رمز "آخر" في طريقة (الشكل 2). انقر على "إعداد الصك" الرمز في طريقة لفتح نافذة. تكوين labwares عن طريق سحب الرموز لP50 LLS تصفيتها نصائح، نصائح P200 LLS تصفيتها، P1000 نصائح، "Matrix_OneML_TubeRack"، وهما "SmallTuberack_microfugetubes"، وخزان للموقع على سطح السفينة المقابلة من القائمة رمز. فتح مربع حوار ل "Matrix_OneML_TubeRack" واسم "AB_BOX". فتح مربع حوار ل "SmallTuberack_microfugetubes" واسم واحد باسم "BASE_CT" لالكوكتيلات قاعدة والآخر باسم "ACT_CT" لتنشيط الكوكتيلات (الشكل 5). سحب "نقل" رمز لأسلوب (الشكل 2) لإضافة خطوة لنقل العازلة من الخزان إلى أنابيب microfuge ل "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". حجم نقل = 25 ميكرولتر س (# من تلطيخ +2) ل "كوكتيل قاعدة" و= 25 ميكرولتر س (# من تلطيخ +2) ل "كوكتيل التنشيط". إضافة خطوات لتحريك "Matrix_OneML_TubeRack" على قارئ الباركود 2D. سحب "VisionMate نقل" رمز لأسلوب (فايجوري 2) وتحديد الانتقال من موقف سطح السفينة الأولي للقارئ الباركود موقف على سطح السفينة. سحب "VisionMate: قراءة الباركود" رمز لأسلوب (الشكل 2). فتح مربع الحوار، واختيار "VisionMate" كجهاز واسم مجموعة البيانات باسم "BC_Read". سحب "وقفة المستخدم" (الشكل 2)، حدد "توقف النظام برمته وعرض هذه الرسالة" وكتابة تعليق في حقل لتذكير مستخدمي مؤكدا أن تتم قراءة كل الباركود قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.22-3.1.26 سيربط بين المواقع جيدا وأسماء الأجسام المضادة باستخدام معلومات الباركود. وهذا سيمكن معالج السائل الآلي للعثور على مكان وجود الأجسام المضادة معين استنادا إلى اسم الضد "AB". سحب "التقارير الخطوة" رمز لأسلوب (الشكل 2). جعل ملف نصي باستخدام برنامج نص وحفظهكما "BC_Readout" في مجلد المستندات على الكمبيوتر. فتح مربع حوار ل "الإبلاغ عن الخطوة"، اختر "ملف نصي" لتقرير نمط، وحدد الملف "BC_Readout" من خلال التصفح. ملاحظة: سوف يحتوي على ملف "BC_Readout" مما أدى المعلومات لجميع labwares على سطح السفينة إلا النصائح كما تم تكوينها في 3.1.16 بما في ذلك معلومات عن الباركود يقرأ الأنابيب الباركود 2D و مواقع جيدة في "Matrix_OneML_TubeRack". إضافة "إنشاء مجموعة البيانات" خطوة لربط الباركود والمعلومات جيدا. اسحب "إنشاء مجموعة البيانات" رمز لأسلوب (الشكل 2)، انقر عليه لفتح مربع الحوار، اختر "إقرأ من ملف" وحدد "AB_BC.csv" (الجدول رقم 2 التي تم إنشاؤها في 2.4) تحقق "فاصلة- فواصل "و" الملف يحتوي على صف الرأس ". ملاحظة: في إطار معاينة الملف، أسماء الأجسام المضادة (AB) والباركود يقرأ (ق) يجب أن ينظر إليه. في الصورةمربع الحوار AME عن "إنشاء مجموعة البيانات" في 3.1.25، حدد "VM1" للموقع المختبرات و"0" عمق كومة، حدد "تطابق معرف نموذج"، واستخدام الحقل "BC" لتتناسب مع البيانات ضبط "BC_Read". حدد "AB" و "ق" ل "مجموعات البيانات المراد إنشاؤها" (الشكل 6). سحب "VisionMate نقل" رمز لأسلوب (الشكل 2) وتحديد الانتقال من موقف قارئ الباركود "VM1" مرة أخرى إلى نقطة على سطح السفينة الأولي على سطح السفينة. ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.28-3.1.33 تحديد خطوة نقل ل "كوكتيل قاعدة". سحب "Worklist" أيقونة (الشكل 2) وتصفح لتحديد ملف worklist "Base_CT_P50" (الجدول 3) التي تم إنشاؤها في 3.1.1. تحقق "حلقة worklist بأكمله". اسحب "نقل" رمز مباشرة تحت رمز "Worklist" (الشكل 2). </ لى> انقر على "نقل" رمز لفتح مجال المواصفات. اختيار واحد فقط من تحقيقات، P50 LLS تصفيتها نصائح، حدد "يفرغ منها" عندما يتم نقل، وتحقق "نصائح تغيير بين التحويلات". إضافة مصدر بالنقر على "اضغط هنا لإضافة مصدر"، حدد "Matrix_OneML_TubeRack" باعتباره معدات المختبرات، وحدد الموقع على سطح السفينة بالاسم "AB_BOX". في مجال مواصفات "نقل"، "تكبير" على الرسم البياني من 96 بئرا بالنقر بزر الفأرة الأيمن واختيار "AB" مباشرة بعد "مجموعة البيانات الاستخدام" وحدد المكان قيمها "تساوي" و "= AB_NAME" . اختر تقنية نقل الاختيار. ملاحظة: ينصح بشدة استخدام LLS لتجنب الحصول على الحطام عجل قرب القاع. في مجال مواصفات "نقل"، حدد وجهة بالنقر على "اضغط هنا لإضافة وجهة"، انقر بزر الماوس الأيمن لتكبير وحدد "SmallTuberack_microfugetubes "باعتباره معدات المختبرات، وحجم بأنها" = VOL "، وموقع على سطح السفينة بالاسم" BASE_CT ". وبعد التصغير، انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى، تحقق" تحديد اختيار كنص "، وتحقق" تحديد الأهداف مع التعبير أدناه: "ونوع" = WELL_BASE "كمتغير لمنصب سطح السفينة الوجهة. كرر 3.1.29-3.1.32 مماثل ل "كوكتيل قاعدة" مع نصائح P200، من خلال تحديد ملف CSV "Base_CT_P200" (الجدول 4) ثم اختر P200 LLS تصفيتها نصائح فضلا عن تقنية ماصة المناسبة لP200 LLS نصائح تصفيتها. ملاحظة: الخطوات التالية 3.1.34 و3.1.35 ستحدد خطوة نقل ل "كوكتيل التنشيط". كرر 3.1.29-3.1.32 مماثل ل "كوكتيل التنشيط" مع نصائح P50، من خلال تحديد ملف CSV "ACT_CT_P50" (الجدول 5) واختيار "ACT_CT" كوجهة. انقر بزر الماوس الأيمن على جهة وتحقق "تحديد اختيار كنص"،. تحقق "تحديد الأهداف مع التعبير التالي:" ونوع "= WELL_ACT" كمتغير لمنصب الوجهة. كرر 3.1.34 مماثل ل "كوكتيل التنشيط" مع نصائح P200، من خلال تحديد ملف CSV "ACT_CT_P200" (الجدول 6) ونصائح P200 LLS تصفيتها. ملاحظة: طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط" يمكن أن تكون مغلقة بعد حفظه. إنشاء طريقة جديدة لصنع "ماستر الجسم المضاد كوكتيل" من خلال الجمع بين "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل تفعيل" إلى 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع (الشكل 7). ملاحظة: الخطوات التالية 3.2.1-3.2.6 وتحديد المختبرات: رف أنبوب مع 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع. يتم توفير الأرقام لتكون مرجعا. يجب أن المحققين تحديد وضبط للصك. في شريط الأدوات في إطار "المشروع"، حدد "ابوار نوع المحرر". بزر الماوس الأيمن البنودإك على كائن لرف 24 موقف، اختر "نسخ" واكتب "BiocisionCoolRack_XT" في نافذة منبثقة. انقر نقرا مزدوجا فوق على الكائن "BiocisionCoolRack_XT" لفتح مربع الحوار. تسليط الضوء على "معلومات أساسية"، تعيين 12.78 سم (X) و8.57 سم (Y) ل "سبان" و 7.93 سم ل "الطول". تسليط الضوء على "Well_1". تعيين على النحو التالي: "حسنا أوفست". 1.55 سم (X) و 1.33 سم (ص): "حسنا عد". 6 (X) و 4 (ص): "حسنا تباعد". 1.95 (X) و1.97 (Y)، "حجم الحد الأقصى". 2000 ميكرولتر، تنسيق "، منتظم،" كولوم 2 أوفست "، 0، و" وحدة التخزين الافتراضي ". 0. فتح "تكوين حسنا" لتحريرها. تعيين على النحو التالي: "شكل". جولة "العليا الشعاع". 0،5375 سم، "الشعاع السفلى". 0.48 سم، و "الطول". 7.07 سم. تحقق "القسم أسفل" وتعيين "الشكل". نصف الكرة الأرضية، و "الشعاع". 0.45 سم. ملاحظة: الخطوات التالية3.2.6-3.2.7 ستحدد الخطوات نقل ويمكن استخدامها في الخطوة 3.2.14. إنشاء ملف CSV "AB_MACT" (الجدول 7) لصنع الأجسام المضادة كوكتيل مع رؤوس التالية: أ) "SRC_BASE". اسم المختبرات ل "كوكتيل قاعدة"، ب) "WELL_BASE". كذلك مواقع في المختبرات ل "كوكتيل قاعدة"، ج) "VOL_BASE". حجم نقل ل "كوكتيل قاعدة" في ميكرولتر، د) "SRC_ACT". اسم المختبرات ل "كوكتيل التنشيط"، ه) "WELL_ACT". كذلك مواقع في المختبرات ل "كوكتيل التنشيط"، و) "VOL_ACT". حجم نقل ل "كوكتيل التنشيط" في ميكرولتر، ز) "DEST_MACT". معلومات الموقع سطح السفينة ل "ماستر كوكتيل الأجسام المضادة"، وح) "WELL_MACT". كذلك وضع المعلومات في رف أنبوب ل "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". ملء المعلومات تحت رؤوس إنشاؤها في 3.2.6) (جدول رقم 7) على النحو التالي: أ) استخدام "BASE_CT"تحت SRC_BASE، ب) المعلومات القائمة أيضا موقع "WELL_BASE" كما هو مبين في الشكل 3A، ج) قائمة إجمالي حجم الأجسام المضادة (25 ميكرولتر من العازلة + مجموع كل التتر الضد قاعدة لتلطيخ واحد) تحت عنوان "VOL_BASE"، د) استخدام "ACT_CT" تحت SRC_ACT، ه) معلومات الموقع قائمة جيد ل "WELL_BASE" كما هو مبين في الشكل 3B، و) الحجم الإجمالي لائحة من الأجسام المضادة (25 ميكرولتر من العازلة + مجموع كل التتر تنشيط الأجسام المضادة للتلطيخ واحد) تحت عنوان "VOL_ACT". نقل 25 ميكرولتر من العازلة للتي خلية FM3. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لاختبارات 1-3، ز) استخدام "SPL_TUBES_1" (انظر 3.2.10) ل "DEST_MACT"، وح) القائمة كذلك معلومات موقع "WELL_MACT" كما هو موضح في الشكل (8). ملاحظة: الخطوات التالية 3.2.8-3.2.15 وبرمجة طريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد" فتح طريقة جديدة (الشكل 7). اسحب "Instrument الإعداد "رمز للطريقة الجديدة (الشكل 7). في مجال مواصفات "إعداد الصك"، الرموز السحب للحصول على نصائح P1000، وهما "SmallTuberack_microfugetubes"، و "BiocisionCoolRack_XT" على الرسم البياني سطح السفينة. فتح مربع حوار ل "SmallTuberack_microfugetubes" اثنين واسم "BASE_CT" و "ACT_CT"، على التوالي، على النحو المحدد في 3.1.17. فتح مربع حوار ل "BiocisionCoolRack_XT" واسم "SPL_TUBES_1" كما هو محدد في 3.2.7 (الشكل 9). إضافة "المجموعة" الجديدة عن طريق سحب الرمز "المجموعة" إلى أسلوب (الشكل 7). اسحب "نقل من ملف" رمز مباشرة تحت رمز "المجموعة" لنقل "كوكتيل قاعدة" لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد" (الشكل 7). في مجال مواصفات "نقل من ملف"، اختر النصائح P1000 في استخدام، قالمنتخب "يفرغ منها" عندما يتم نقل، وتحقق "نصائح تغيير بين التحويلات". في مجال مواصفات "نقل من ملف"، حدد الملف "AB_MACT" (جدول رقم 7) من خلال التصفح، تحقق "ملف يحتوي على صف الرأس". حدد "SRC_BASE" لموقف مصدر المختبرات و"WELL_BASE" للحصول على معلومات بشكل جيد في المختبرات المصدر، حدد "DEST_MACT" لمعدات المختبرات جهة و"WELL_MACT" للحصول على معلومات بشكل جيد في المختبرات جهة، وحدد "VOL_BASE" للحصول على معلومات حجم (الشكل 10). اختار تقنية نقل المناسبة للحصول على نصائح P1000. ملاحظة: LLS قد لا يكون ضروريا لهذه العملية. إضافة آخر "نقل من ملف" عن طريق سحبه مباشرة تحت "المجموعة" لنقل "كوكتيل تفعيل" هذا هو لأن تكون مختلطة مع "كوكتيل قاعدة" لصنع "ماستر الجسم المضاد كوكتيل" (الشكل 7 </ قوي>). وضع مماثل حتى خطوة نقل كما هو الحال في 3.2.13 و3.2.14. الاستثناءات هي على النحو التالي: أ) حدد "SRC_ACT" لموقف مصدر معدات المختبرات، ب) "WELL_ACT" للحصول على معلومات بشكل جيد في المختبرات المصدر، وج) "VOL_ACT" للحصول على معلومات الحجم. 4. إجراء التشغيل أولا، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز البرنامج لإطلاق قارئ الباركود 2D على الكمبيوتر. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق رمز البرنامج لإطلاق معالج السائل الآلي على الكمبيوتر. تحت عنوان "صك"، حدد "الرئيسية للمحاور" لحقن الرئيسية للمعالج السائل الآلي. تأكد من أن جميع المحاقن لا تحتوي على فقاعات الهواء مرئية. ملاحظة: "الرئيسية للمحاور" وأيضا إعطاء الصك نقطة مرجعية يمكن من خلالها اتخاذ خطوات لاحقة. فتح طريقة لجعل "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل تفعيل" (الشكل 2) في البرنامج للمعالج السائل utomated. وضع أنابيب microfuge إلى "SmallTuberack_microfugetubes" ل "BASE_CT" و "ACT_CT" وفقا لعدد من "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط" ليتم (الشكل 3). ثم وضعها على سطح السفينة وفقا "لإعداد الصك" (الشكل 5). وضع الخزان مع عازلة على سطح السفينة وفقا "لإعداد الصك". دي سقف أنابيب الباركود 2D التي تحتوي على أجسام مضادة باستخدام 8 قنوات سقف المسمار decapper. تبقي مباراة دولية في الترتيب الدقيق على صينية كاب القابضة لتفادي انتقال التلوث. وضع "Matrix_OneML_TubeRack" على سطح السفينة وفقا "لإعداد الصك" (الشكل 5). مكان P50 LLS نصائح تصفيتها، P200 LLS نصائح تصفيتها، ونصائح P1000 على سطح السفينة وفقا "لإعداد الصك" (الشكل 5). بدء تشغيل الأسلوب بالنقر فوق ثلاثي الأخضرعلى شكل زاوية رمز البداية. كما هو مطلوب من النافذة المنبثقة، والتأكد من أن جميع العناصر على سطح السفينة تطابق "إعداد الصك" على النحو المحدد في الأسلوب. لا تضع أي الكائنات التي لم يتم سردها في "إعداد الصك" على سطح السفينة، وهذا يمكن أن سحق جراب و / أو القابض. اضغط على "موافق" للمتابعة. بعد نقل "Matrix_OneML_TubeRack" على قارئ الباركود 2D وقراءة الباركود، ونافذة منبثقة آخر يسأل ما إذا كان يتم قراءة الباركود جميع. المضي قدما من خلال الضغط على "موافق" وأكد مرة. عند الانتهاء من التحويل عن طريق معالج السائل الآلي، باختصار الأنابيب barcoded 2D باستخدام 8 قنوات سقف المسمار decapper، ووضعها من جديد إلى 4 درجات مئوية. دوامة جميع أنابيب microfuge بقوة لمدة 20 ثانية، وإعادتها إلى الرفوف أنبوب. ملاحظة: vortexing لعدم كفاية قد يؤدي إلى تلطيخ الأمثل من الخلايا. إغلاق طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". ثم فتح طريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". إعداد 5 مل أنابيب البوليسترين وصفت ما قبل جولة القاع على "BiocisionCoolRack_XT" (الشكل 8) ووضعه على سطح السفينة. وينبغي أن تبين تسميات ما "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل تفعيل" مختلطة، فضلا عن هوية المريض المناسب. وضع رفوف أنبوب ل "كوكتيل قاعدة"، "كوكتيل التنشيط"، ونصائح P1000 على سطح السفينة (الشكل 9). بدء طريقة (الشكل 7). كما هو مطلوب من النافذة المنبثقة، وتأكد من أن البنود الواردة في مباراة سطح السفينة الإعداد دور فعال في طريقة (الشكل 9). اضغط على "موافق" للمتابعة. عندما تتم العملية المذكورة أعلاه، يدويا إضافة 50 ميكرولتر من عينات الدم في كل 5 مل جولة القاع أنبوب البوليسترين الذي يحتوي على كوكتيل الأجسام المضادة. أنابيب العينات دوامة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية واحتضان 15 دقيقة في RT في الظلام. تاكالرعاية الإلكترونية لتجنب تسليط الضوء الدم على جانبي الأنابيب، لأن هذا سيؤدي إلى تلطيخ غير متناسقة. إزالة بعناية أي الشرائط من الدم عن طريق قطعة قطن مبللة بالماء وغسل العازلة التدفق. إضافة 1 مل من العازلة تحلل RBC يدويا واحتضان 15 دقيقة في RT في الظلام. إضافة 2 مل من غسل العازلة التدفق (0.1٪ أزيد الصوديوم، 1٪ BSA، 10 U / مل الهيبارين في 1X HBSS) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. تجاهل طاف داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. تكرار عملية الغسيل هذه. إعادة تعليق الخلايا الملون في 0.5 مل من غسل العازلة التدفق. إعداد وتجهيز تدفق عداد الكريات أنه مع الليزر الدقيق والفلاتر المناسبة، وتشغيل العينات باستخدام 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع. استخدام المعايرة والتعويض مضان أساليب الكريات موحدة لجمع البيانات 12،15. جمع جميع المعلمات المدرجة في "FLUOROPHORE" في الجدول 1. ملاحظة: يجب استخدام مواد المكافحة المناسبة في كل شوط لضمان الحمار السليمأداء آي. بعد عينات تشغيل، اكتسبت تصدير البيانات والملفات FCS. تحليل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة. تحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية باستخدام استراتيجية النابضة التي حددها مشروع المناعة البشرية 1.
Representative Results
هدف كله المناعي في الدم هو الحصول على الكمية (لترسيم فرعية الخلايا المناعية) و (تفعيل كشف الحالة) معلومات نوعية على الخلايا المناعية. لقد معدلة بشكل طفيف تي لوحة خلية المناعي المقترحة من قبل مشروع المناعة البشرية 1 إلى تحسين الأداء العام للأسلوبنا (الجدول 1). وتهدف لدينا لوحة الخلايا التائية لتحديد ساذجة والذاكرة المركزية (CM)، ذاكرة المستجيب (EM)، والمستجيب خلايا تي. باختصار، نحن تميز الحلل على أساس FCS-A وFCS-H. ثم نحن بوابة على الخلايا الليمفاوية على أساس الجانب مبعثر ومستويات CD45. ثم يتم تحديد خلايا T من التعبير عن CD3. وتختلف الخلايا CD3 + T إلى خلايا T γδ وαβ خلايا تي. وتنقسم الخلايا αβ تي الى مزيد من خلايا CD4 + و CD8 + T. ثم يتم تحليل خلايا CD4 + و CD8 + T لمجموعات فرعية على أساس expressioن من CD45RA وCCR7: CD45RA – CCR7 + CM، CD45RA + CCR7 + السذاجة، CD45RA + CCR7 – المستجيب، وCD45RA – CCR7 – EM خلايا تي 1. بالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا مراقبة التعبير عنها من علامات تفعيل مثل CD38، HLA-DR، الأعلام، PD-1، GITR، 4-1BB، CD69، NKG2D، وOX40 للحصول على المعلومات النوعية. للتدليل على دقة هذه الطريقة، نحن الملون عينات الدم الكامل الطرفية من 4 المتبرعين الأصحاء 5 مرات في يوم واحد. ويبين الشكل (11) والعلاقة بين بالمئة تي خلية حيوانية على الخلايا الليمفاوية بوابات ومعامل في المئة من التباين (٪ CV). ويرد بيان تفصيلي من القطعان خلية في المئة تي في الخلايا الليمفاوية بوابات و٪ السيرة الذاتية لكل فرعية في الجدول 8. بيانات من الاختبارات 2 و 3 ليست مدرجة في الشكل 11 والجدول رقم 8 لالبساطة. أقل من 25٪ السيرة الذاتيةبين المدى (بين فحص دقة) وقد اقترح لمعايير القبول لفحوصات العلامات البيولوجية المظهرية للاستخدام البحوث 10. اجتمع جميع القياسات هذه المعايير باستثناء خلايا الأعلام + γδ T (26،64 حتي 46،39٪. الجدول 8) والخلايا الأعلام + CD8 T (14،64 حتي 58،39٪. الجدول 8). وتظهر هذه القيم لأغراض العرض التوضيحي. نحن لا تستخدم هذه القياسات لالأعلام يلعب أساسا دورا هاما في تنشيط خلايا CD4 T 16. وقد لوحظ اتجاه ارتفاع٪ السيرة الذاتية في السكان الذين يشكلون نسبة منخفضة بالنسبة إلى مجموع السكان من قبل الآخرين (7). في حالة المحققين مهتمون في رصد الأحداث النادرة، فحص عدد الخلايا الاحتياجات إلى زيادة في أجل التغلب على أكبر الدقة 17. معا، وتشير البيانات المتوفرة لدينا نجاح نشر الأتمتة في إعداد عينة من كامل المناعي في الدم. < IMG بديل = "الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" /> الشكل 1. سير العمل لالمناعي مع الدم الكامل الطرفية. خطوة خطوة سير العمل من فحص immunophenotypic هو مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. لمحة عامة عن طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". وتظهر خطوات في طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط" في برنامج لمعالج السائل الآلي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. ه 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/> الشكل 3. تخطيط لرف أنبوب مع BACE_CT وACT_CT. (A) يدل على تخطيط لرف أنبوب "BACE_CT". (ب) يظهر تخطيط لأنبوب رف "ACT_CT". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. تعريف المختبرات الطبية للحامل أنبوب مع أنابيب الباركود 2D. الخطوة خطوة عملية لتحديد حامل أنبوب مع أنابيب الباركود 2D. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 485fig5.jpg "/> الرقم 5. إعداد صك طريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". ويظهر تخطيط سطح السفينة لطريقة لصنع "كوكتيل قاعدة" و "كوكتيل التنشيط". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 6. الإعداد ل"إنشاء مجموعة البيانات". ويظهر وضع مفصل ل "مجموعة البيانات خلق". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. فيقو إعادة 7. نظرة عامة على طريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". ويرد خطوات في طريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد" في برنامج لمعالج السائل الآلي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 8. تخطيط لرف أنبوب مع 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع. ويظهر تخطيط لأنبوب رف "SPL_TUBES_1". FM3 يعني مضان ناقص 3 (البنفسجي اللامع 421، فيكوإيريترين، وallophycocyanin). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/> الرقم 9. إعداد صك طريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". ويظهر تخطيط سطح السفينة لطريقة لصنع "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 10. الإعداد ل "نقل من ملف". ويظهر وضع مفصل عن "نقل من ملف". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 11. منخفضة فاري وتظهر القدرة في شبه الآلي المناعي الدم الكامل. القيم السيرة الذاتية واحدة من جميع السكان خلية تحليل من أربعة المتبرعين الأصحاء كحلقة مفتوحة الزرقاء. يظهر منحنى الانحدار في الخط الأزرق. أحمر منقط خطوط تشير العصابات ثقة 95٪ وخطوط الجشع تنتشر تظهر 95٪ العصابات التنبؤ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وقد أجريت الرقم 12. مثال على تلطيخ الأمثل. تلطيخ مع vortexing لكافية أو غير كافية من أنابيب microfuge من "BACE_CT" و "ACT_CT". هناك نوعان من السكان مسور في (ب). السكان طفيفة مع ضعف تلطيخ CD45 يمثل الخلايا التي لا تحصل على تلطيخ الأمثل.g12large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مجموعة علامة FLUOROPHORE استنساخ عيار (ميكرولتر / تلطيخ) قاعدة كوكتيل TCELL CD45 FITC 2D1 0.4 CD3 Alexa700 UCHT1 1 CD8 APC-H7 SK1 0.4 CD4 PerCP-CY5.5 SK3 2 CCR7 PE-CF594 150503 1 CD45RA PE-Cy7 L48 1 TCRab BV786 </td> T10B9.1A-31 1 TCRgd BV650 B1 5 التنشيط كوكتيل-1 TEST1 HLA-DR BV421 G46-6 5 CD278 (الأعلام) PE DX29 5 CD38 APC HB7 1 التنشيط كوكتيل-2 TEST2 CD279 (PD1) BV421 EH12.1 2.5 CD357 (GITR) PE eBioAITR 5 CD137 (41BB) APC 4B4-1 10 التنشيط كوكتيل-3 TEST3 CD69 BV421 FN50 1 </td> CD314 (NKG2D) PE 1D11 2 CD134 (OX40) APC ACT35 5 الجدول 1. وجود قائمة الأجسام المضادة لوحة الخلايا التائية المعدلة. AB قبل الميلاد CD45_FITC 0163562388 CD3_Alexa700 0163562110 CD4_PerCP_CY5.5 0163562364 CD8_APC-H7 0163562363 CCR7_PE-CF594 0163562387 CD45RA_PE-Cy7 0163562091 TCRab_BV786 0163562069 TCRgd_BV650 0163562108 <tد> A_HLA-DR_BV421 0163562339 A_CD278 (الأعلام) _PE 0163562082 A_CD38_APC 0163562317 A_CD279 (PD1) _BV421 0163562340 A_CD357 (GITR) _PE 0163562093 A_CD137 (41BB) _APC 0163562315 A_CD69_BV421 0163562341 A_CD314 (NKG2D) _PE 0163562314 A_CD134 (OX40) _APC 0163562316 الجدول 2. أسماء الأجسام المضادة مع أرقام الباركود 2D. مجموعة WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL 1 <tد> CD8_APC-H7 7.2 TCELL 1 CD45_FITC 7.2 TCELL 1 CD3_Alexa700 18 TCELL 1 CCR7_PE-CF594 18 TCELL 1 CD45RA_PE-Cy7 18 TCELL 1 TCRab_BV786 18 الجدول 3. ملف "BASE_CT_P50": أسماء الأضداد ومعلومات وحدة تخزين. مجموعة WELL_BASE AB_NAME VOL TCELL </td> 1 CD4_PerCP_CY5.5 36 TCELL 1 TCRgd_BV650 90 الجدول 4. ملف "BASE_CT_P200": أسماء الأضداد ومعلومات وحدة تخزين. مجموعة WELL_ACT AB_NAME VOL TEST1 7 A_HLA-DR_BV421 30 TEST1 7 A_CD278 (الأعلام) _PE 30 TEST1 7 A_CD38_APC 6 TEST2 13 A_CD279 (PD1) _BV421 15 TEST2 13 A_CD357 (GITR) _PE 30 TEST3 19 A_CD314 (NKG2D) _PE 12 TEST3 19 A_CD69_BV421 6 TEST3 19 A_CD134 (OX40) _APC 30 الجدول 5. ملف "ACT_ CT_P50": أسماء الأضداد ومعلومات وحدة تخزين. مجموعة WELL_ACT AB_NAME VOL TEST2 13 A_CD137 (41BB) _APC 60 الجدول 6. ملف "ACT_CT _P200": أسماء الأضداد ومعلومات وحدة تخزين. الجهات المانحة # SRC_ قاعدة قاعدة كوكتيل حسنا_ قاعدة VOL_ قاعدة SRC_ACT ACTI- VATION كوكتيل حسنا_ فعل VOL_ACT DEST_MACT حسنا_ MACT HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 </tد> 1 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 7 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 13 HD001 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 19 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 2 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 <tد> ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 8 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 14 HD002 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 20 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 3 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 9 <tr> HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 13 42.5 SPL_TUBES_1 15 HD003 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 21 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT FM3 1 25 SPL_TUBES_1 4 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST1 7 36 SPL_TUBES_1 10 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST2 </tد> 13 42.5 SPL_TUBES_1 16 HD004 BASE_CT TCELL 1 36.8 ACT_CT TEST3 19 33 SPL_TUBES_1 22 الجدول 7. ملف "AB_MACT": المصدر والمعلومات المقصود ل "كوكتيل ماستر الجسم المضاد". # السكان في الشكل. 1 أنا ثانيا ثالثا رابعا الخامس اسم السكان CD3 + خلايا أساسها T خلايا T كلمة المدير العام CD3 + CD4 + CD3 + CD8 + ٪ من الخلايا الليمفاوية </td> Heathly المانحة # 1 79.80 75.20 2.70 49.60 22.30 Heathly المانحة # 2 69.40 61.90 5.85 44.40 16.20 Heathly المانحة # 3 75.80 69.60 4.75 42.00 23.50 Heathly المانحة # 4 77.20 73.50 1.98 52.70 18.90 ٪السيرة الذاتية Heathly المانحة # 1 1.42 1.58 3.70 2.50 1.56 Heathly المانحة # 2 2.48 2.39 5.74 2.82 2.41 Heathly المانحة # 3 1.15 1.40 6.32 1.42 2.72 Heathly المانحة # 4 0.81 0.94 5.45 1.20 1.44 متوسط 1.47 1.58 5.30 1.99 2.03 الانحراف المعياري 0.72 0.61 1.13 0.79 0.63 الجدول 8. بيانات أولية لل٪ من الخلايا الليمفاوية و٪ السيرة الذاتية لكل فرعية المرسومة في الشكل 4. لاحظ أن البيانات لاختبارات 2 و 3 لا تظهر في الشكل (5) والجدول 8 إلى تبسيط عرض البيانات.
Discussion
المناعي من الدم المحيطي مهم للغاية من أجل الحصول على نظرة ثاقبة الاستجابات الفردية إلى العلاج المناعي. ويكمن التحدي في توحيد فحص للسيطرة على تجربة إلى تجربة تقلب 1،14. واحد المصدر الرئيسي للتقلب يكمن في التلاعب البشري من العينات. لذلك، فمن المتصور أن الأتمتة الكامل أو الجزئي للتجهيز العينات سيسهل انخفاض هائل في تجربة إلى تجربة تقلب 1،14. في هذا البروتوكول، ونحن التقرير محاولة ناجحة لدينا للحد من تقلب فحص عن طريق إدخال معالج السائل الآلي مجهزة 2D قارئ الباركود لتلطيخ عينة في كامل المناعي في الدم.
في التصميم وطريقتنا هي متعددة، ويمكن رصد مجموعات فرعية المناعية الأخرى بإضافة إضافية "كوكتيل قاعدة" لتحدد لهم. وتشمل هذه فرعية الخلايا التائية المساعدة والخلايا التنظيمية تي، الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا الجذعية، وحيدات (مخطوطة فيإعداد) 18. نحن تكييفها لوحات الأجسام المضادة أوصى الكونسورتيوم عن طريق إدخال إضافية علامات 1. وقد تم تحديد السكان الخلية باستخدام "كوكتيل قاعدة" مترافق إلى fluorochromes مع الحد الأدنى من الانبعاثات في البنفسجي اللامع 421 (BV421)، فيكوإيريترين (PE)، وallophycocyanin (APC) كاشفات، كما كنا نريد أن نحتفظ هذه القنوات للكشف عن مستضدات محرض. هذه الميزة لا يضمن فقط أعلى حساسية لمراقبة حالة تنشيط الخلايا المناعية ولكن يمكن أيضا الإقامة مرنة من علامات تفعيل جديدة كما في معظم الأحيان يتم مترافق هذه fluorochromes ثلاثة مع الأجسام المضادة ضد علامات محرض. لذلك، لدينا وسيلة ليست فقط مناسبة لإعداد الكوكتيل لكامل المناعي الدم ولكن مفيد أيضا لتلطيخ عينات أخرى بما في ذلك الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي والخلايا المستخرجة من أنسجة مصنفة (على سبيل المثال، ورم).
مقدمة ناجحةالدرفلة الجديد من أسلوبنا يتطلب اهتماما خاصا لالخطوات في إعداد المختبرات، وبرمجة وتنفيذ الأسلوب. ويشمل إعداد أنابيب الباركود 2D وضع العلامات مع علامات للقراءة البشرية ونقل الأجسام المضادة للأنابيب المعينة. لمنع دخول من أخطاء، ونحن نوصي بذلك مع شخصين. كلما تغيير جداول البيانات، يجب أن المحققين تحقق ما إذا كان الأسلوب يعمل بشكل صحيح. اختيار أساليب pipetting لمناسبة خلال برمجة يضمن نجاح نقل السائل. LLS تمكن pipetting لمن دون الحصول على الحطام عجلت من أسفل أنابيب الأجسام المضادة، التي نستخدمها إما P50 أو P200 نصائح موصل. قد لا يكون LLS خيارا جيدا للحصول على نصائح P1000 كما LLS هو أكثر حساسية مع نصائح P1000 وأحيانا تسبب زورا جود فقاعات. ارتفاعات في تعريف المختبرات ينبغي تعديل لكل أداة يمكن أن يحدث نقل السائل كما الأمثل، على سبيل المثال، إذا لم تكن هناك مساحة كافية بين حافة نصائحوالجزء السفلي من الأنابيب. كما هو مبين في الشكل (12)، إذا لم يتم vortexed في "كوكتيل قاعدة" و / أو "كوكتيل تفعيل" حسنا، فإنه قد يؤدي إلى تلطيخ الأمثل.
فكرنا باستخدام الكواشف مجفف بالتجميد لتلطيخ خلية كنهج بديل للحد من تقلب ذات الصلة مع كاشف الاستغناء عن 19. ومع ذلك، ومن المعروف تقارن البوليمر الأصباغ البنفسجي رائعة للتفاعل مع كل الإشارات تسبب أخرى غير محددة. على هذا النحو، إضافة أكثر من اثنين تقارن البوليمر (على سبيل المثال، BV421 وBV650 الخ) في الكواشف مجفف بالتجميد قد يسبب إشارات غير محددة (على سبيل المثال، زيادة إشارة BV650 الخلفية في BV421 + السكان) 20. وعلاوة على ذلك، الكواشف مجفف بالتجميد تفتقر إلى المرونة لإدراج تلطيخ الجديد. أنها عادة ما تكون أكثر تكلفة، ويتطلب النظام السائبة. لهذه الأسباب، اخترنا لاستخدام معالج السائل الآلي مجهزة أنابيب الباركود 2D. على الرغم من أنها تاكيس الوقت لإعداد وينطوي على الاستثمار مقدما لشراء الصك، على المدى البعيد سيتم تعويض هذه العوامل لعن طريق زيادة الإنتاجية واستنساخ المقايسات. في الواقع، مجموعات قليلة أعلنت في وقت سابق الاندماج الناجح للمعالج السائل الآلي في سير العمل من المناعي أو تطبيقات مماثلة 21،22. الحلول الآلية لتحليل التدفق الخلوي المتوفرة من مصادر تجارية (FACS SPA الثالث، كوكتيل الآلي إعداد محطات العمل، وFlowStainer) أيضا. ويدل ذلك أيضا أن هناك حاجة ماسة لإعداد كوكتيل الآلي لالمناعي.
بعد اتقان هذه التقنية، فإننا نتصور أن تطوير مؤتمتة بالكامل المناعي الدم كله يؤدي إلى تقليل التباين التجربة إلى التجربة وقد يجعل كله المناعي الدم ممكنا حتى في التجارب السريرية متعددة المراكز تحديد 23. لقد بدأت بالفعل باستخدام كان ليزمساعد ح لأتمتة تحلل وغسل الخطوات. نحن نتصور أيضا أن تقرير الآلي من حجم الأجسام المضادة في أنابيب الباركود 2D وتتبع الاستغناء كاشف سوف تحسن كثيرا من المخزون من الأجسام المضادة والسيطرة النوعية على طريقتنا، على التوالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
Cite This Article
Koguchi, Y., Gonzalez, I. L., Meeuwsen, T. L., Miller, W. L., Haley, D. P., Tanibata-Branham, A. N., Bahjat, K. S. A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (108), e53485, doi:10.3791/53485 (2016).