リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

in vivoイメージングでは 、ほとんどの生理的な文脈における細胞の挙動の直接可視化を提供します。ゼブラフィッシュの胚の透明性、その迅速かつ外部の開発と蛍光標識を可能にする遺伝子ツールの豊富なアレイは、すべてのキーの発達のイベントのダイナミクスを解明するためにin vivoでの顕微鏡の利用拡大に貢献しています。ゼブラフィッシュにおける神経系の発達のイメージング研究では、例えば大幅に神経前駆細胞の挙動とそれに続く遊走、分化および回路の集積^1-8を含むそれらの子孫の運命の我々の知識を拡大しています。

ステージは、現在、これらの細胞の挙動の基礎となる細胞内動態を調査するために設定されています。確かに、ゼブラフィッシュは、既にin vivoでの細胞生物学のためのツールとして利用されています。ミトコンドリア^9-11を可視化できるようになりました^2,8,12-14を中心体、ゴルジ¹⁵、微小管⁴およびアクチン細胞骨格¹⁶は^、17エンドソームおよびin vivoでのゼブラフィッシュ胚における他の細胞内構造の中で^、1,18頂端膜の構成成分の複雑な。これまでのところ、これらの細胞小器官の機能について知られていることの多くは、培養細胞中で彼らの行動を研究から来ています。 in vitro試験は、細胞生物学に多大な洞察が得られているが、培養中の細胞は、完全にin vivoでの状況の複雑さを表すものではありませんので、必ずしも生体内での細胞内小器官の機能とダイナミクスを反映するものではありません。ゼブラフィッシュの胚は、細胞内ダイナミクスを調べるためにインビボ代替中の生存を提供しています。

脊椎動物としては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物種に見られるものと相同であり、多くの器官系（ 例えば、神経網膜）を有します。さらに、ゼブラフィッシュの胚はますます人間の病気^19,20をモデル化するために使用されています</sアップ>、中心体の機能（ 例えば、小頭²¹およびレーバー先天性黒内障^22）とのミトコンドリア機能（ 例えば、パーキンソン病^{23は 、10,24}およびバルト症候群²⁵タウオパチー）に関連するものを含む。細胞および細胞下レベルでのin vivoイメージングこれらの例では、これらの病理学的状態の根底にある細胞生物学のより良い理解を可能にします。

ここに記載された方法の全体的な目標は、 インビボでの光学顕微鏡に用いゼブラフィッシュ胚における器官及び他の細胞内構造を調査するために総合的なガイドを提供することです。 in vivoでの細胞内構造を可視化し、追跡に関わる全体の作業の流れを説明する-遺伝的標識アプローチから、一時的に生成し発現させ、安定したトランスジェニック魚、そして最終的に広視野と共焦点顕微鏡を使用して画像化することに。これらのprocの各一方、eduresは、多数のゼブラフィッシュの研究室で使用されて、記載されているプロトコルは、最適化され、細胞内構造のダイナミクスを調査するための合理化されています。ここで説明する作業の2つの特定の側面は言及に値する：まず、遺伝的に複数の構成でのGal4-UAS発現系の使用は、特定の細胞型における細胞小器官にラベルを付けます。第二に、in vivoでの画像細胞内構造に広視野と共焦点顕微鏡の直接比較。

ゼブラフィッシュにおける遺伝的にラベル細胞小器官および他の細胞内構造への現在の戦略のいずれかにするプロモーター要素が直接融合タンパク質^9,14,15。 インビトロ転写キャッピングされたRNAの結果での発現を駆動するキャップされたmRNA ^1,4,8またはDNAに基づく構築物の使用しかし、組織特異的ではありません迅速かつ広範な表現、。キャップされたRNAは希釈または分解されるようにさらに、発現レベルは経時的に減少します。 RNAのこのように使用するベース開発の後の段階でオルガネラダイナミクスを調べるために構築する（通常は最大3日後に受精）制限されます。

これらの制限は、発現の空間的および時間的制御は、特定のプロモーターエレメントにより決定されるDNA構築物を使用することによって克服することができます。 DNAベースの構築物のGal4-UASシステムの文脈で使用される場合、導入遺伝子発現レベルに有意な改善が^26,27を観察しています。レポーター遺伝子は、Gal4の結合性上流活性化配列（UAS）の下流にクローニングされている間、この二部式システムでは、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子GAL4の発現を駆動します。適切なGal4のドライバとUASレポーターを組み合わせることによって、発現が異なるプロモーターの後ろに特異的な発現パターンが所望されるたびに、レポーター遺伝子をクローニングする必要性を回避し、特定の細胞型に限定することができます。また、複数のUASレポーター遺伝子の発現をすることができ単一のGal4活性化因子によって駆動されます。 Gal4-UASシステムは、このように細胞内標識化のための汎用性と柔軟な遺伝的なアプローチを提供します。

広い視野と共焦点顕微鏡は、ほとんどの研究室の主力です。広視野システムは、典型的には、光源として、アークランプを使用して、光路の端部に配置されている敏感なカメラで放射された光を検出します。アウトオブフォーカスライトは、厚い試料での合焦情報を覆い隠すように、このイメージングモダリティは、典型的には、薄いサンプルに制限されています。共焦点顕微鏡は、彼らが焦点（ すなわち 、「光学切片^」）28のうち、発信するものの上に焦点面からの発信信号を優先するように構築されているという点で、広視野システムとは異なります。光学セクショニングを達成するために、ピンホールは、点光源に共役な位置に排出経路に配置されます。レーザーが光源として使用され、信号は、光電子増倍管（PMT）で検出されます。具体的には、レーザービームは、試料によってポイントツーポイント及び各スポット（ピクセル）での蛍光発光は、PMTによって検出さにわたって通されます。

ここでは画像の両方顕微鏡モダリティの直接比較を提供するために、広視野および共焦点顕微鏡法の両方を使用してゼブラフィッシュ胚生体において全く同じ細胞内構造。このような比較を提供する基礎となる目的は、手元の特定の質問に最も適切な顕微鏡技術を選択するためのガイドラインを提供することです。

ここで説明する手法を用いて、我々は、ミトコンドリアと中心体ののGal4 UASベースの遺伝的標識化を実証します。これらの細胞小器官は、各撮像モダリティの適合性を実証するために広視野共焦点顕微鏡を用いて、神経系の異なる細胞型内および筋肉細胞内に結像されます。ここで説明する方法は、容易に生きたゼブラフィッシュ胚における他の細胞小器官および細胞内構造を調査するために適合させることができます。