Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Se propone un nuevo método para la extracción en fase sólida (SPE) de muestras de agua del medio ambiente. El prototipo desarrollado es rentable y fácil de usar, y permite realizar SPE rápida, automatizada y sencilla. La solución de pre-concentrada es compatible con el análisis por inmunoensayo, con un contenido de disolvente orgánico de bajo. Se describe un método para la extracción y pre-concentración de hormona natural 17β-estradiol en muestras de 100 ml de agua. SPE en fase inversa se realiza con sorbente octadecil-sílice y la elución se realiza con 200 l de metanol 50% v / v. Eluyente se diluye mediante la adición de agua DI para reducir la cantidad de metanol. Después de preparar manualmente la columna de la SPE, el procedimiento general se realiza automáticamente dentro de 1 hora. Al final del proceso, la concentración de estradiol se mide mediante el uso de un ensayo de inmuno-sorbente ligado a enzima comercial (ELISA). 100 veces pre-concentración se consigue y el contenido de metanol en sólo el 10% v / v. Recuperaciones completas de la moléculase consiguen con 1 ng / L claveteado muestras desionizada y sintéticos de agua de mar.
Introduction
Preparación de la muestra es un paso importante en cualquier proceso analítico. En particular, la eliminación de los efectos de matriz, disminución de interferencias, y el enriquecimiento de la sustancia analizada son necesarios para obtener resultados precisos y llegar a los límites de detección bajos. Compuestos disruptores endocrinos (EDC) son de particular interés debido a su acción sobre los organismos vivos, incluso cuando están presentes en niveles muy bajos en el medio ambiente. La hormona natural 17β-estradiol está presente en la contaminación de las aguas de la UE Lista de Vigilancia y propenso a ser añadido a la lista de sustancias prioritarias reguladas por la Directiva Marco del Agua. Extracción en fase sólida (SPE) se aplica comúnmente para el análisis de pequeños contaminantes en el agua, con tanto químicos 1-5 (cromatografía, espectrometría de masas) y 6-9 métodos de detección inmunológicos. Este último ganó interés en el campo de la vigilancia del medio ambiente, como los inmunoensayos están disponibles en gran variedad de formatos, son específicos de la target analito, y alcanzar límites de detección bajos. 6, 7, 10, 11 Varios ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) están disponibles comercialmente y permiten analizar múltiples muestras a la vez en una placa de múltiples pocillos. El procedimiento consiste en las etapas de reacción sucesivas que pueden tardar un par de horas. El producto final de la reacción se puede detectar ópticamente para determinar la concentración de la molécula diana sobre la base de una curva de calibración.
Procedimientos clásicos SPE incluyen sorbente pre-acondicionado, extracción de la muestra, lavado, elución, y la concentración por evaporación del eluyente. El disolvente utilizado para la dilución de este extracto se elige en función del método de detección. Para los métodos inmunológicos, la cantidad de influencias disolventes orgánicos fuertemente la sensibilidad del método. 12
Además de la recuperación y las actuaciones pre-concentración, el método también debe ser sencilla y rentable. Automatización del procedure ayuda a reducir los errores relacionados con humanos. En nuestro trabajo anterior 13 introdujimos nuestro prototipo para SPE automatizado, y nuestro método se aplicó al análisis de la hormona natural 17β-estradiol en muestras de agua de mar. Con el presente vídeo nos gustaría resaltar las ventajas técnicas de aplicación de este método en comparación con los tradicionales off-line y on-line SPE, y su compatibilidad especial con detección por inmuno-reacciones. Se describe el protocolo aplicado a muestras de agua para la detección de 17β-estradiol. SPE se realiza con octadecil-sílice (C18) fase sorbente y la elución se realiza con metanol diluido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se propuso un nuevo método para la preparación de muestras de agua, seguido de análisis mediante inmunoensayo. El instrumento permite realizar extracción en fase sólida en una forma automatizada y fácil de usar.
La filtración de la muestra de agua antes de su inyección en el sistema es crítico. Cualquier partículas aún presentes en la solución sería potencialmente causar la obstrucción de la red fluídica y obstruir la columna de la SPE. Otro paso importante es la preparación …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
