פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em> Cre-לקס</em> מודלי עכבר
Summary
תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.
Abstract
משטח אפיתל במעי היונקים הוא רקמה דינמית שמחדשת כל 3-7 ימים. הבנת תהליך התחדשות זו זיהתה אוכלוסייה של מהירות רכיבה על אופניים תאי גזע מעיים (ISCs) מאופיינים בביטוים של גני Lgr5. אלה נתמכים על ידי אוכלוסייה שקטה תאי גזע, מסומנת על ידי ביטוי BMI-1, מסוגל להחליף אותם במקרה של פציעה. חוקר את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה הוא חיוני להבנת תפקידם במחלות וסרטן. ISCs קיימת בתוך מאורות על פני השטח המעיים, נישות אלה תומכים בISC בחידוש epithelia. האינטראקציה בין ISCs הפעיל והשקט סבירה כרוכה תאים מובחנים אחרים בתוך הנישה, כפי שכבר בעבר הוכיח כי '' stemness '' של ISC Lgr5 קשור באופן הדוק לנוכחות של תאי פנט השכנים. שימוש בעכבר cre-לקס מותנהדגמים שבדקו את ההשפעה של מחיקה רוב ISCs הפעיל בנוכחות או עדר של תאי פנט. כאן אנו מתארים את הטכניקות והניתוח התחייבו מאפיין את המעי ולהוכיח שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתוך הנישה ISC בסיוע ההתאוששות הבאה עלבון משמעותי.
Introduction
משטח luminal של מעי היונקים תכונות חוזר יחידות של מאורות ואצבע כמו תחזיות, כינה villi, שבולט לתוך הלום. משטח זה הוא גיליון רציף של epithelia שעובר התחדשות עצמית מלאה כל 3 כ – 4 ימים 1. רקמה דינמית זו נתמכת על ידי אוכלוסייה במהירות רכיבה על אופניים בתאי גזע (ISCs; הידוע גם בבסיס קריפטה תאי עמודים), אשר בתחילה זוהו על ידי הביטוי שלהם של גן Lgr5 2,3. תאים אלה קיימים בנישה מיוחדת בתחתית מאורות של Lieberkuhn. בתחילה, הגילוי שהיה רכיבה על אופניים במהירות ISCs היה צורם עם הרעיון הרווח שתאי גזע היו שקטים בטבע. קודם לזיהוי Lgr5 + ISC הוא הניח שאוכלוסייה של תווית שקטה שמירת תאים בעמדה 4, ביחס לבסיס של קריפטה, היו ISCs 1. h המחקר אחרוןכמו עכשיו השלים תצפיות אלה על ידי הוכחה כי בעיקר יש בריכה של רכיבה על אופניים equipotent ISCs בכל כוך שגורלם מוסדרים על ידי שכנותיה 4,5. במקרה שהם איבדו יכולים להיות מוחלפים על ידי תאים אלה שקטים שבדרך מחויבים לשושלת ההפרשה אך יכול לחזור לISCs אם אוכלוסיית ISC פגומה 6.
שכנים ISC יכולים להיות או ISCs או תאי הבת שלהם. ISCs לייצר תאי בת נאיביים שרבו ולהתמיין לסוגי תאים מיוחדים המרכיבים את גיליון אפיתל שקווי לומן מעי 1. הגביע, enteroendocrine, enterocytes, ציצה ותאי M להעביר כלפי מעלה אל פני השטח luminal שבו הם מספקים פונקציות הקליטה ורגולטורים שונות, לעומת זאת, תאי פנט יישארו בתחתית הכוך שבו הם קיימים התערבבו עם ISCs. בשנים האחרונות זה כבר הוכיח כי חלקם של daught הנאיבי תאים אה מיועדים לשושלת הפרשה הם תווית שקטה שמירת תאי Lgr5 lo מסוגלים חוזר לISC על פציעת 6,7.
בשל חשיבותו בהתחדשות קריפטה עדיפות הונחה על הבנת יחסי הגומלין בין ISCs ושכנותיה, במיוחד תאי פנט. תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בנישה שתומכת ISCs 8. בנוסף למוצרי bactericidal תאי פנט לייצר מולקולות איתות המפעילות את המסלולים המסדירים חידוש ISC או בידול. מחקרים קודמים הראו כי Lgr5 + ISCs יכול להתקיים רק כאשר הם יכולים להתחרות על אותות נישה חיוניים הניתנים על ידי תאי פנט בתם 8. מחקרים אלו בדקו את התפקיד של תאי פנט על Lgr5 הרגיל + ISCs ולא במצב שבו הם פגומים ודורשים חידוש מאוכלוסיית Lgr5 lo.
<p class = "jove_content"> כדי להבין מחלה ביולוגיה ומודל מעיים אנו בוחנים את התפקיד הפונקציונלי של תאים ו / או גנים באמצעות מודלים עכבר מהונדסים 9,10. לעתים קרובות מודלים אלה לנצל את טכנולוגית cre-לקס לשנות גן (ים) 9,10 תנאי. Cre (גורם רקומבינציה) recombinase הוא recombinase אתר ספציפי של משפחת אינטגראז, מבודד מP1 bacteriophage. Cre catalyses רקומבינציה הספציפית אתר בין BP המוגדר 34 ' לקס P '(χ מוקד P1 מוצלב) אתרים. עכברים מהונדסים גנטית להכיל אתרי LoxP כי האגף אזורים של עניין שעל ביטוי של recombinase Cre הם נכרת. קישור הביטוי של גן Cre לתא או אמרגן ספציפי התפתחותי מאפשר שינוי להתבצע בצורה מרחבית 9,10, זה שימושי במיוחד בהתגברות על מוטציות קטלניות עובריות. נוסף המקשר את ביטוי Cre למסלול קולט,כי יכול להיות מופעל באופן מלאכותי, מאפשר שינויים זמניים.שימוש בטכנולוגיה זו אנו מומת גן CatnB 11 בepithelia המעיים. β-קטנין, מוצר גן CatnB, הוא רגולטור מרכזי של מסלול איתות Wnt הקנונית אשר מסדיר הומאוסטזיס ISC. שני מחקרים קודמים באמצעות אסטרטגיה זו הניבו תוצאות סותרות 12,13. המחקר על ידי Fevr et al. 12, הפגין אובדן של תאי גזע והומאוסטזיס מעיים. ואילו אירלנד et al. 14 מחקר דיווח כי בעקבות ירידה בכדאיויות תא הציר קריפטה-סיסי היה אוכלס מחדש מהתאים מהסוג בר להביע CatnB. ההבדל העיקרי במחקרים אלה היה האמרגן משמש להביע Cre בepithelia המעיים. Et al Fevr., מחקר השתמש אמרגן גן villin הצמוד לקולטן אסטרוגן שיכול להיות מופעל על ידי מתן tamoxifen (T2 ויל-Cre-ER) 15,16. בניגוד אירלנד et al., ניצלה את אלמנט האמרגן של גן P450A1 ציטוכרום החולדה (CYP1A1) לנהוג ביטוי Cre בתגובה לβ-naphthoflavone xenobiotic (אה-Cre). המאפיינים של המערכות השונות הללו נוצרו שתי השערות לחשבון לתצפיות שונות אלה. הראשון שCatnB נמחק בצורה יעילה יותר בISC באמצעות מערכת T2 ויל-Cre-ER לעומת אה-cre, ובכך להפחית את מספר ISCs לרמות תת-אכלוס. לחלופין היה זה בשל דיפרנציאלי מחיקת CatnB באוכלוסיית התאים המובחן. מטרות מערכת T2 ויל-Cre-ER כל תאי האפיתל של הכוך וסיסי ואילו מערכת אה-Cre מטרות רק תאים-פנט שאינו של הנישה ISC וקריפטה. מערכות אלה סיפקו כלים אידיאליים לבחינת behavIOR של ISCs והאינטראקציה שלהם עם תאי פנט. כאן אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על אופן בו אנו משמשים מערכות אלה כדי לקבוע שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתיווך תגובת המעיים לפציעה 17.
Protocol
מידע על כל החומר המשמש הוא נתון בטבלה 1. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו תחת סמכות רישיון פרויקט של משרד פנים בריטי. 1. CatnB מחיקה באמצעות אה-cre ו- Cre-ER יל מערכות T2 לחצות את זני העכברים לייצר 10 – קבוצות בת 14 בשבוע של אה-Cre + CatnB + / +, אה-Cre + CatnB flox / flox, ויל-Cre-ER T2 CatnB + / + ויל-Cre-ER T2 CatnB flox / Flox. לניתוח חזותי של רקומבינציה, באמצעות כתם -gal β, קבוצות צריכה להכיל את כתב Rosa26R-lacZ 17. קבוצות צריכים לשלוט על נוכחותם של גנים ושימוש בסוכני אינדוקציה שונה, בגודל של קבוצות הנדרשות צריכים להיות מוערכים באמצעות ניתוח כוח. כדי לגרום לtransgene אה-Cre להכין β; -Naphthoflavone (BNF), או לtransgene T2 ויל-Cre-ER טמוקסיפן (TAM) בשמן תירס לתת פתרון עבודה של 10 מ"ג / מיליליטר. הערה: יש לשקול את הסוכנים במנדף באמצעות מיגון אישי מתאים. פתרונות חום בבקבוק ענבר (BNF הוא רגיש לאור) לשתי מעלות צלזיוס 99.9 לBNF או 80 מעלות צלזיוס למשך TAM באמבט מים. מעבירים לבוחש מחומם נקבע על 100 מעלות צלזיוס במשך BNF, או 80 מעלות צלזיוס למשך TAM, ומערבבים במשך 10 דקות. לBNF לחזור 1.3-1.4 עד שהיא נמסה (יכולה לקחת> 1 שעה). Aliquot לתוך בקבוקי ענבר קטנים (~ 5 מיליליטר) ולאחר מכן להקפיא ב -20 ° C. צריכים להיות מושלכים בקבוקים לאחר מחזורי 3 הקפאה / הפשרה. לפני שימוש סוכני הפשרה ולחמם לטמפרטורה מתאימה אם הם נפלו מפתרון. אפשר להתקרר ל< 37 מעלות צלזיוס לפני ההזרקה. הזרק עכברי intraperitoneally (IP) עם מינון של 80 מ"ג / קילוגרם, למשל עכבר 25 גרם מקבל 0.2 מיליליטר של appropסוכן האינדוקציה riate. לאה-Cre לספק שלוש זריקות בתקופת 24 שעות, לT2 ויל-Cre-ER לתת זריקה אחת ליום במשך 4 ימים. 2. Dissection של מעי וליזואליזציה הכתב ואימונוהיסטוכימיה (IHC) להרדים את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה לפני בהתאם לאישור אתי. מניחים את העכבר במצב שכיבה ולהרטיב את הפרווה באמצעות EtOH 70%, לפתוח את החלל תוך הצפק longitudinally לאורך קו האמצע באמצעות מספריים. אבטח את הבטן עם מלקחיים ולנתק את החיבור לוושט. הסר את המעי הדק עד הנספח ידי משייכתו בעדינות על הבטן. הסר את המעי גס עד הטבעת על ידי משייכתו בעדינות על הנספח. ברגע שהמעיים היו מבודדים להסיר את הבטן ונספח. מעיים סומק עם 1x PBS באמצעות מזרק עם קצה פיפטה הסתיימה בוטה. הערה: כל מעי צריך להיות אניmmediately מעובד לאחד היישומים במורד הזרם המתוארים להלן. 3. פורמלין קיבוע של מעי חותך את המעי הסמוק ל -3 חלקים שווים בגודל והפרוקסימלי תווית, אמצע ודיסטלי. חותך כל חלק לחתיכות 1 סנטימטר. קח רצועה קטנה של 2 סנטימטרים X 2 סנטימטר קלטת כירורגית. מניחים 3-5 חתיכות 1 סנטימטר על לאמצע הקלטת כירורגית במערך פירמידה. לסגור ולאטום את הקלטת סביב החתיכות לאורך זמן, כדי לתת אפקט "ערימת יומן". מניחים רקמות במכל שטוח תחתית המכיל עודף גדול של מקבע ניטראלי שנאגרו פורמלין, לפחות 10x היקף מקבע לנפח של רקמה. הערה: הימנע מהצבת כמויות עודפות של רקמה בתוך צינור לקיבעון, לחלק אותו למכל מרובה. דגימות מקום ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 18 – 24 שעות לפני ההטבעה והחתך. כדי למנוע אובדן של β-קטנין הגרעיני, לא לתקן מעבר 24 שעות.לאחר רקמת העברת הקיבעון למכל שטוח תחתית המכיל עודף גדול של 70% EtOH, לפחות 10x הנפח של רקמה. 4. Methacarn קיבוע של מעי לפני הנתיחה להכין מקבע methacarn על ידי שילוב של 300 מיליליטר MeOH, חומצת 150 מיליליטר כלורופורם ו -75 מיליליטר קרחונים אצטית (4: 1: 2). חותך את המעי הסמוק ל 3 חלקים בגודל שווים הפרוקסימלי, אמצע ודיסטלי. מניחים כל חתיכת צד מעי על ידי צד על פיסת נייר סינון (סנטימטר x15 15 סנטימטרים) ובאמצעות springbow מספריים לפתוח אותו "en פנים". מניחים את המעי ונייר סינון לתוך צלחת זכוכית המכילה methacarn במשך 3 – 24 שעות בRT. לאחר הקיבוע להרים את סוף סעיף מעי באמצעות מלקחיים. בסופו של המעי סביב המלקחיים כדי ליצור "גליל שוויצרי" ולאבטח את הגליל על ידי מעט פתיחת המלקחיים ולשים מחט 25 G דרכו. מניחים רקמות במכל שטוח תחתית המכיל laעודף rge של מקבע ניטראלי שנאגרו פורמלין, לפחות 10x היקף מקבע לנפח רקמה וחנות במשך שעה לפחות 1 לפני שתמשיך לעיבוד. 5. הר שלם LacZ יזואליזציה (השתנה מאל et al Marjou. 18) הכן צלחות שעווה על ידי שילוב של ralwax המותך עם שמן מינרלים ב 10: 1. יוצקים לתוך 15 צלחות פטרי סנטימטר ומניח להצטנן. הכן מקבע X-gal בהתאם לטבלת 1 ולאחסן על קרח. הסר כל מעי ולשטוף דרך עם 1x קר כקרח PBS, כאמור בסעיף 2. מעי תקן על ידי שטיפה עם 25 מיליליטר מקבע X-gal קר כקרח. באמצעות מספריים לחתוך את המעי ל3 – 5 חלקים שווים (מקסימום 5 לכל צלחת). מניחים כל חלק על גבי צלחת שעווה ולהצמיד כל סוף כל כך הסעיף נמתח מעט עם הקו העליון mesenteric; לקצץ כל לפדר עודף. באמצעות מספריים springbow לחתוך את בטן longitudinally ולהצמיד את הדרך.60; להציף את הצלחת עם מקבע X-gal כדי לכסות את החלקים ולהשאיר למשך שעה לפחות 1 על 4 מעלות צלזיוס. הסר מקבע X-gal בעזרת פיפטה 25 מ"ל ולשטוף פעם אחת עם 30 מיליליטר של 1x PBS. סעיפי כיסוי עם 30 מיליליטר של תמיסת demucifying DTT ל30 – 60 דקות ב RT, באופן אידיאלי על פלטפורמת נדנדה. הסר פתרון demucifiying בעזרת פיפטה 25 מ"ל ולהציף את הצלחת עם 30 מיליליטר של 1x PBS. בעזרת פיפטה פסטר לשטוף את חלקי מעי עם PBS 1x בצלחת כדי להסיר ריר. הסר PBS 1x עם טפטפת 25 מיליליטר ומבול עם 30 מיליליטר של כתם X-gal. דגירה הלילה ב RT בחושך עם תסיסה עדינה על פלטפורמת נדנדה. בעקבות בדיקת הדגירה הלילה שהסעיפים פיתחו כתם כחול / ירוק, אם את צבע הרקע הוא עדיין לבן, פתרון מכתים טרי ניתן להוסיף ומעקב עד מכתים מתפתח. הערה: ברגע שיש לי סעיפים מוכתמים אז יכול להיות ניסה לא מכתים נוסף. להסיר את כתם X-galבאמצעות צלחת פיפטה והמבול 25 מיליליטר עם 30 מיליליטר של 1x PBS ולהשאיר למשך 3 דקות עם תסיסה עדינה. הסר סיכות ולהרים, עם מלקחיים, סוף סעיף מעי. בסופו של המעי סביב המלקחיים כדי ליצור "גליל שוויצרי", לאבטח את הגליל על ידי מעט פתיחת המלקחיים ולשים מחט 25 G דרכו. מניחים רקמות במכל רחב פה שטוח תחתית המכיל עודף גדול של מקבע ניטראלי שנאגרו פורמלין, לפחות 10x היקף מקבע לנפח של רקמה. דגימות מקום ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני ההטבעה והחתך. 6. הפקה של מאורות ממעי לבודד 20 סנטימטרים הראשונים של המעי הדק, כאמור בסעיף 2. מקום המעי על משטח נקי ולנתח באמצעות מלקחיים ומספריים להסיר כל שומן / לפדר מצורף. באמצעות מספריים springbow לפתוח את הבטן longitudinally. שימוש בכיסוי שקופיות מיקרוסקופ, וirmly לגרד לומן המעי להסיר villi וריר. באמצעות מספריים לחתוך את המעי ל~ 5 חתיכות מ"מ ולהעביר לתוך צינור 50 מיליליטר עם 25 מיליליטר 1x HBSS בתוספת פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 U / ml). דגירה של 10 דקות ב RT. הסר את המדיה האנטיביוטי המכיל על ידי העברת הדגימות דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. הנח סעיפים במעי לתוך צינור 50 מיליליטר טרי המכיל 10 מיליליטר 1x HBSS ולהחליף את הכובע. בעדינות להפוך פעמיים ולהסיר את HBSS 1x על ידי עובר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. נוסף לשטוף את החלקים במעי על ידי חזרה על 6.4 & 6.5 שלוש פעמים ולהבטיח שהחלק הסופי הוא יחסית ברור. העבר את הרקמה לצינור 50 מיליליטר טרי המכיל 10 מיליליטר של EDTA (8 מ"מ) / 1x HBSS ולהשאיר על RT במשך 5 דקות. לנער במרץ (20 – 30x) או מערבולת, עובר דרך 70 מיקרומטר חתיכות מסננת תא ורקמה להעביר צינור 50 מיליליטר טרי המכיל EDTA (8 מ"מ) / 1x HBSS. הערה:הזרימה דרך באפשרות להיות מושלך או להיעזר במידת צורך הניתוח של epithelia villi. דגירה חתיכות רקמה על קרח למשך 30 דקות, לנער את המדגם במרץ (20 – 30x) או מערבולת. להעביר את הדגימות דרך מסננת תא 70μm ולשמר את הזרימה דרך כמו זה מכיל את מאורות. העבר את פיסות רקמה לצינור 50 מיליליטר טרי המכיל 10 מיליליטר של 1x HBSS. לנער במרץ (20 – 30x) או מערבולת, עובר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ולשמר את הזרימה דרך. חזור עוד פעם אחת כדי להבטיח התאוששות המרבית של מאורות מחתיכות מעיים. מערבבים את הזרימה דרך שברים וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. יוצקים את supernatant ולשמור את כדור קריפטה. הערה: ניתן להשתמש בכדורים באופן מיידי לculturing (אם קיימים) או לאחסן ב -80 ° C לפני הליכי מיצוי DNA / RNA / חלבון סטנדרטיים. ויזואליזציה 7. תקן אימונוהיסטוכימיים חותך 5 μחלקים מ 'של רקמה מוטבעת פרפין על פולי-L ליזין שקופיות (PLL). הערה: פרוטוקול סטנדרטי לצביעה עם נוגדן B-קטנין הוא כדלקמן, מקבלים פרמטרים לנוגדנים אחרים בטבלה 2. דה-שעווה עם 2x 3 שוטף דקות באמבטיות שקופית המכילות קסילן הטרי. רעננות על ידי העברת שקופיות עבור 3 דקות באמצעות אמבטיות שקופית המכילות טרי: 100% EtOH (2x), 95% EtOH וEtOH 70% ולבסוף ל1x PBS. שקופיות מקום לאמבטית שקופית המכילה מאגר ציטראט (pH 6) וחום 99.9 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לאחזר אנטיגנים. לאפשר שקופיות להתקרר ולאחר מכן לשטוף 3x 5 דקות באמבט שקופית המכיל 1xTBS / T במשך 5 דקות. הסר שקופיות מלשטוף אחרון, מייד לצייר סביב רקמה עם עט PAP, ולכסות את החלק עם בלוק מסחרי peroxidase או H 1.5% 2 O 2 (ב H 2 O מזוקק). דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר (RT) ולאחר מכן לשטוף 3x באמבטיות שקופית המכילות TBS 1x הטרי / T במשך 5 דקות. לאחר שטיפהing סעיפי כיסוי, בעזרת פיפטה, ב5% סרום ארנב רגיל (NRS) / 1xTBS / T למשך 30 דקות ב RT לחסום מחייבות הידרופובי הלא ספציפי של הנוגדן הראשוני שלך. הסר בלוק NRS עם סעיף פיפטה וכיסוי פסטר בנוגדן ראשוני B-קטנין בדילול 1: 200 עם NRS 5%. לשטוף שקופיות 3x 5 דקות באמבטיות שקופית המכילות 1xTBS הטרי / T. שים לב – נוגדנים אחרים ידרשו אופטימיזציה לדילול וספציפיות. כדי להבטיח הספציפיות של נוגדן, צריכים להתבצע לא כתמי שליטת נוגדן ואלוטיפ מתאימים. שליטת אלוטיפ מותאמת למיני מארח ואלוטיפ של הנוגדן הראשוני שלך. דמיין גם עם ערכת זיהוי HRP מסחרית או עם נוגדן מתאים שכותרתו fluorescently משנית (טבלה 2). הערה: אורך של פיתוח שונה לכל נוגדן, לβ-קטנין 10 – 15 שניות היא בדרך כלל מספיק. כדי לייעל את הפיתוח לest הראשון נוגדןablish את משך הזמן הנדרש כדי לחזות תאים חיוביים באמצעות שקופיות בקרה חיוביות ולאחר מכן להחיל את זה על כל השקופיות שלאחר מכן. לשטוף שקופיות 3x 5 דקות באמבטיות שקופית המכילות TBS / T הטרי. Counterstain שקופיות ידי טבילה באמבט המכיל haematoxylin שקופית ל~ 45 שניות (לא נדרש אם באמצעות כותרתו fluorescently נוגדנים משני). שים שקופיות לתוך אמבט שקופית נקי ולשטוף עם מים זורמים ברז ל~ 1 דקות, הבטחת haematoxylin לא נשטף לחלוטין. מייבשים שקופיות על ידי עובר דרך מרחצאות שקופית המכיל הגדלת ריכוזים של אלכוהול; 1x 30 שניות ב -70% ETOH, 1x 30 שניות ב -95% EtOH, 2x 30 שטיפות שניות ב 100% EtOH, 2x 2 דקות קסילן. הר שקופיות תחת coverslip באמצעות תקשורת הרכבה מסחרית. הערה: אם משתמש בנוגדן שכותרתו fluorescently הר עם מדיה המכילה DAPI לתייג את הגרעין. 8. היסטולוגית זיהוי של Intestina ספציפיתאי אפיתל l Enterocytes הכן חלקים באמצעות סעיף 7 עם נוגדן villin ותנאים המתוארים בטבלה 2. תאי Entero-האנדוקרינית (Grimelius להכתים 18,19). הכן חלקים על ידי הבא 7.1-7.2 צעדים. לשטוף מחליק באמבטית שקופית המכילה מים ultrapure 3 דקות. העברת השקופיות לאמבטית שקופית המכילה פתרון כסף שחומם מראש (טבלת 1) ולדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הסר את השקופיות מפתרון הכסף והמקום באמבט שקופית המכיל פתרון מפחית חומם מראש מוכן טרי (טבלה 2) על 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר את השקופיות והמקום לתוך אמבטיה שקופית המכילה מים ultrapure טריים במשך 3 דקות. בצע את השלבים 7.6-7.8 מסעיף 7. תאי גביע (כתם הכחול Alcian). הכן חלקים על ידי הצעדים הבאים 7.1-7.2 .. העברת שקופיות לאמבטית שקופית המכילה Alcian BlpH UE 2.5 במשך 5 דקות על RT. להסיר את הכתם כחול Alcian עם אמבטיה שקופית פיפטה והמקום תחת ברז ריצה במשך 3 – 5 דקות. עקוב 7.6-7.8 צעדים. הערה: פתרון הכחול Alcian ניתן להיעזר לשימוש נוסף. ISCs. כדי לזהות את ISCs אחרי סעיף 9. תאי פנט. הכן סעיפים הבאים סעיף 7 באמצעות נוגדן יזוזים ותנאים המתוארים בטבלה 2. 9. באתרו RNA איתור עם Murine המעי 19-21 מקום 5 מיקרומטר חלקים ממעי קבוע פורמלין (סעיף 3) על גבי שקופיות PLL. הכן בדיקה RNA digoxigenin שהכותרת לינארית לאיתור ביטוי Olfm4 21. שעוות ורעננותם סעיפים כאמור בסעיף 7. הערה: פרוטוקול זה צריך להתבצע בסביבה חופשית RNAse כדי למנוע השפלה של חללית RNA. לצייר סביב tבעיה עם עט PAP כדי למזער חומרים כימיים. סעיפי דגירה באמבט שקופיות עם 6% H 2 O 2 (ב H 2 O מזוקק) למשך 30 דקות. לשטוף פעמיים באמבט עם שקופיות טרי 1x PBS במשך 3 דקות. בטל PBS 1x ו, בעזרת פיפטה, סעיף כיסוי עם paraformaldehyde 4% במשך 20 דקות על קרח. לשטוף פעמיים באמבט עם שקופיות טרי 1x PBS במשך 3 דקות. שימוש בכיסוי פיפטה חלקים עם פתרון proteinase K במשך 5 דקות לשטוף באמבטית שקופיות עם טרי 1x PBS במשך 3 דקות. שימוש בחלקים שלאחר תיקון-פיפטה על ידי הכיסוי בparaformaldehyde 4% במשך 5 דקות על RT. לשטוף באמבטית שקופיות עם טופל DEPC H 2 0 2 דקות. שימוש בסעיפי כיסוי פיפטה בפתרון אנהידריד אצטית במשך 10 דקות עם תסיסה. לשטוף באמבטית שקופיות עם 1x PBS / 3 דקות טריות, ואחריו 1x מלוח / 3 דקות. עובר שקופיות באמצעות אמבטיות המכילות הגדלת ריכוזים של אלכוהול; 1x 30 שניות ב -70% ETOH, 1x 30 שניות ב -95% EtOH, 2x 30 שטיפות שניות ב 100% טריים EtOH,2x 2 דקות בקסילן הטרי ולאפשר לאוויר יבש. לדלל הבדיקה Olfm4 1: 100 במאגר הכלאה ולפגל בדיקה על ידי חימום ל80C 3 דקות. החל מבדיקת 100 μl לכל סעיף ולכסות עם parafilm על מנת למנוע התייבשות של השקופית. דגירה הלילה בחדר חשוך, לח ב 65 ג. לשטוף באמבטית שקופיות עם 5 × SSC ב 65 צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף חלקים באמבט שקופית פעמיים עם פוראמיד 50% טריים / 5 × SSC / 1% SDS למשך 30 דקות ב 65 ג. לשטוף חלקים פעמיים באמבט שקופיות בPBT הטרי במשך 10 דקות, הראשונה ב 65 C והשני ב RT. שימוש בכיסוי פיפטה חלקים עם PBT המכיל 25 מיקרוגרם RNAse במשך 45 דקות ב 37 מעלות. לשטוף חלקים באמבט שקופיות בPBT במשך 5 דקות על RT. לשטוף חלקים באמבט שקופית פעמיים עם פוראמיד 50% טריים / 5 × SSC למשך 30 דקות ב 65 ג. כדי לחסום, סעיפי כיסוי בעזרת פיפטה עם 10% בסרום כבשים בPBT וחנות בחושך, moiתא רח ב RT עבור 2 – 3 שעות. הכן נוגדנים על ידי דילול נוגדני phosphatase אלקליין אנטי digoxigenin מצומדת בשעת 1: 500 עם 10% בסרום כבשים בPBT המכיל 5 מ"ג / אבקת מעיים עכבר מיליליטר. דגירה של 3 שעות על 4 מעלות צלזיוס בחושך על פלטפורמת נדנדה. ספין למטה כדי להסיר אבקת מעיים עודפת ולהוסיף כרכי 3x של 1% בסרום כבשים בPBT לsupernatant. הסר בלוק משקופיות עם טפטפת ולהוסיף מפתרון הנוגדן 100 μl לכל קטע, לכסות עם parafilm ו דגירה בחדר חשוך, לח על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף חלקים באמבט שקופית 3 × עם PBT הטרי במשך 5 דקות. כדי לחסום חלקים לשטוף באמבטית שקופית 3 × עם חיץ NTMT טרי במשך 5 דקות. כדי להמחיש, באמצעות פיפטה לכסות כל חלק עם BM סגול ודגירה בחושך ב RT עבור 24-72 שעות עד צבע חזק מספיק מתפתח. לשטוף חלקים באמבט שקופיות פעם בPBT וcounterstain ידי הטבילה בeosin דקות 1. רמויש eosin העודף על ידי חלקי כביסה באמבטית שקופיות תחת מים זורמים במשך 3 – 5 דקות. לטבול את השקופיות בקסילן ולאפשר לאוויר יבש. הר תחת coverslip באמצעות תקשורת מסחרית. 10. היסטולוגית אפיון של המעיים epithelia מקום 5 מיקרומטר חלקים מהרקמה הקבוע (סעיף 3 ו -4) על גבי שקופיות PLL. לנתח ≥25 כל אקראי (או ≥50 מחצית) מאורות מ≥4 עכברים של כל קבוצה לכל אחד מהפרמטרים הבאים. הערה: כדי לשמור על עקביות לנתח מאורות מאותו המיקום של כל מעי (להשתמש רק הקצה הפרוקסימלי). פרמטרים סלולריים מסעיפי H & E סטנדרטיים מוכתמים (אלא אם צוין אחרת): קריפטה מספר, גובה, אפופטוזיס ומיטוזה. מספר קריפטה. השתמש בהגדלת צריכת חשמל נמוכה (למשל 4X או 10X) לספור ידני מספר מאורות במגע עם שכבת הבסיס. רוזן ≥10 כת מעי הפרוקסימלי רוחביתיונים מלפחות 4 עכברים. גובה קריפטה. השתמש בהגדלת מתח גבוה (למשל 20X או 40X) לספור ידני את מספר התאים מהחלק התחתון של קריפטה לקריפטה / סיסי ציר (איור 3). 22 אפופטוזיס, 23. שיטה 1: השתמש בהגדלה מתח גבוה (למשל 20X או 40X.) לספור ידני המספרים של תאים אפופטוטיים בכל כוך. ניתן לזהות תאים אפופטוטיים על ידי התכווצות תא, עיבוי הכרומטין, היווצרות שלפוחיות cytoplasmic וגופים אפופטוטיים (איור 3 א). שיטה 2: בצע כתם IHC (סעיף 7) לcaspase-3 באמצעות תנאים שתוארו בטבלה 2 שימוש בהגדלת מתח גבוה (למשל 20X או 40X.) לספור ידני את מספר התאים חיוביים בכל כוך לכמת את התאים ב. שלב ביצוע של אפופטוזיס. מיטוזה. <ol> השתמש בהגדלת מתח גבוה (למשל 20X או 40X) לספור ידני המספרים של תאי mitotic בכל כוך. תאי mitotic מכילים תמצית חומר DNA והם בדרך כלל סימטריים ובנוי היטב (איור 3 ב). שִׂגשׂוּג. בצע כתם IHC (סעיף 7) לקי-67 באמצעות תנאים שתוארו בטבלה 2. ידני לספור תאים חיוביים לכמת את חלקם של התאים מתרבים קריפטה.
Representative Results
השוואת יעילות רקומבינציה ISC באה-cre ויל-Cre-ER מערכות T2 שימוש במערכות cre-לקס אלה להערכת התפקיד של תאי פנט, באכלוס מחדש המעי הבא נזק, האפיון מבוקש ליעילות של רקומבינציה בISCs. שימוש בכתב המותנה Rosa26R-lacZ הראינו כי בשתי המערכות 3 ימים לאחר האינדוקציה (dpi) יש ~ 100 רקומבינציה% במעי הדק (איור 1 א). Quantitating נוכחות אלל recombined ידי qPCR היה מבולבל על ידי ההבדלים בדפוסי ביטוי Cre בין המערכות. מערכת T2 ויל-Cre-ER הראתה גידול של פי 3.53 בנוכחות אלל recombined בהשוואה למערכת אה-cre, בשל ביטויה בחלק גדול יותר של epitheli16. כדי להתגבר על זה אנחנו אימצנו אסטרטגיה שונה שאפשרה לנו להשוות ישירות המערכות. אנו מושרה העכברים עם משטרי אינדוקציה שונים וניתחנו ליום 30 בdpi, שבו מאורות חיוביים LacZ נקודה וסיסי מייצגים אירוע רקומבינציה ISC. שימוש בגישה זו הראינו כי בשתי המערכות, 3 זריקות של סוכן גרימה (IP נמסר על 80 מ"ג / קילוגרם ב -24 שעות), recombined במספר שווה של ISCs למרות רמות רקומבינציה הראשוניות להיות גדול בהרבה וביל-Cre-ER T2 מערכת 16 (ב 1-ד איור). יתר על כן, באמצעות DNA שחולץ ממאורות recombined, qPCR לאללים recombined הפגין עלייה לא משמעותית ברקומבינציה באמצעות מערכת ER T2 ויל-Cre-, שעלול להיות עקב רקומבינציה בתאי פנט לא נצפתה באמצעות המערכת אה-cre (1D איור). יתר על כן, הצביעה לסוגי תאי epithelia לא עשתה הזמנה אישיתקייט בכל שינוי לדפוס בידול, תמונות מייצגות של כל סוג תא חקר מוצגת באיור 2E-2H. אפיון של המעיים epithelia הבא CatnB מחיקה כימות של אובדן קריפטה אפיון קינטיקה של רקומבינציה במערכות Cre אלה אפשרו לנו לנתח את מעי העכבר כאשר מספרים מקבילים של ISCs הם recombined. שימוש בכתב LacZ שני המערכות הראו הפסד של תאי recombined (כחולים) מלא בשעת 3 dpi (איור 2 א). כפי שדווח בעבר שלושה ימים לאחר המחיקה של CatnB העכברים אה-Cre הראו הפסד קריפטה חלקי, ואילו עכברי T2 ויל-Cre-ER הפגינו חורבן קריפטה / סיסי ציר (2b-ד איור) 13,16,24 מלא. </p> דינמיקה של אפיתל Repopulation שימוש בטכניקות לעיל אנו מתאפיינים במספר פרמטרים שתאפשר לנו להבין תצפית זו. (איור 3 א & 3 ב) 10 מקבלים ב– נציג תמונות של הפרמטרים וסוגי תאים נותחו באמצעות פרוטוקולים 7. בקצרה, אובדן מאורות היה עקבי עם הרמות הגבוהות של אפופטוזיס מוצגות בשתי המערכות (3E איור). עם זאת מיטוזה, התפשטות, גובה סלולארי קריפטה, קריפטה והביטוי (לא מוצג) הנתונים מצביעים המערכת אה-Cre יכולה לשחזר, ככל הנראה בשל אכלוס על ידי ISCs-recombined האו"ם (3C איור). בהשוואה גמורה, ויל-Cre-ER T2 לא הצליח להתאושש למרות שמירת תאי אפיתל קריפטה (3D איור). אפיון סלולרי פנוטיפים בתוך קריפטה כדי להבין מדוע מאורות מעכברי CRE-אה יכולים לאכלס מחדש ואילו ויל-Cre-ER T2 לא יכולתי שאפיינו את תאי האפיתל שלושה ימים לאחר המחיקה של CatnB. באמצעות הכלאה באתר (סעיף 9) וניתוח IHC (סעיף 7, 8 ו- 10) הראינו כי תאי קריפטה וביל-Cre-ER T2 CatnB flox / עכברי flox היו בלתי שגשוג וחסר ביטוי של סמן ISC Olfm4 , שלא כמו מאורות בעכברי CRE-אה (איור 4 ג & F). כאפיון הראשוני שהוכיח כי רקומבינציה במאורות הייתה שווה לנו המשכתי לבחון את התפקיד של תאי פנט. ביצענו ניאון כפול IHC נגד CatnB וLyz1 לזהות בו תאים איבדו β-קטנין ואם הם היו תאי פנט (5a-5C איור). כפי שתואר לעיל אנו דemonstrated שכל תאי קריפטה ממוקדים באמצעות מערכת T2 ויל-Cre-ER. בהשוואה למערכת אה-Cre חסכה תאי פנט וepithelia סיסי. תאי פנט נוספים היו רק נצפה עובר אפופטוזיס לאחר מחיקת CatnB שימוש במערכת ויל-Cre-ER T2 (איור 5D & 5e). איור 1: השוואה בין הספציפיות והיעילה של Cre / קס רקומבינציה בתוך epithelia המעיים באמצעות אה-cre ויל-Cre-ER מערכות T2 (א):. יזואליזציה של ביטוי העיתונאי LacZ אה-cre בwholemount הקטן (SI; * קצה הדיסטלי) וגדול (LI; קצה הדיסטלי *) מעכבר סוג בר. (ב): תוצאות של שינוי פי מראה qPCR לאלל CatnB flox recombined בdpi 1 כדי להשוות משטרי אינדוקציה שונים בCatnB flox / flox-Cre אה (BNF מושרה) ויל-Cre-ER T2 CatnB flox / flox (TAM מושרה ); * P> 0.05 (מאן-וויטני [2 זנב] בהשוואה לקבוצת ביקורת). (ג) – (ה):.. קריפטה החיובית LacZ מראה מעי הדק Wholemount 30 לוח dpi (ב) – (ה) שונה מet al פארי 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: השוואה של אה-cre וT2 ויל-Cre-ER <stron ז> מערכות מותנית מחיקת CatnB במעי הקטן epithelia (א):. אובדן מעי דק Wholemount מראה תאי recombined בעכברים אה-Cre CatnB flox / flox LacZ + מעל 3 ימים. (ב): כימות אובדן קריפטה 3 ימים לאחר המחיקה של CatnB; * P> 0.05 (מאן-וויטני [2 זנב] בהשוואה לקבוצת ביקורת). (C & D): סעיפי H & E רוחבית של מעי קבוע פורמלין מפגינים אובדן מאורות לאחר מחיקת CatnB. (ה) – דוגמא לסוגי תאים מעכברי שליטה (ח): (ה) תאי entero-endocriine, (ו) תאי גביע, (ז) CatnB IHC מצביע ISC (→) עם B-קטנין הגרעיני ו( ח) פנט תאים. לוח (ב) שונה מפארי ואח '. 16. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class="jove_content" fo:keep-to gether.within עמודים = "תמיד"> איור 3: אפיון של תחילת הפנוטיפ בעת שימוש באה-cre ויל-Cre-ER מערכות T2 למותנה המחיקה CatnB במספר דומה של ISCs בתוך הקטן מעי epithelia (A ו- B) סעיפי פורמלין המוכתם H & E קבועות המציין את מיקום של קריפטה. גובה ([), אפופטוטיים (←) ותא mitotic (↓). כימות של מספר תאים לכל כוך בין הסוג בר (כחולה) וCatnB flox עכברים (כתומים) הממוצע בשלוש נקודות זמן (dpi) (ג) גובה קריפטה, מיטוזה (ד) ואפופטוזיס (ה) (ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן ). הלוח (ג) – (ה) שונה מן פארי ואח '16."Target =" _ 3429fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4:. השוואה של מאפייני ISC באמצעות אה-cre ויל-Cre-ER מערכות T2 למחיקה מותנה CatnB בתאי אפיתל קריפטה epithelia המעי הדק 3 ימים לאחר המחיקה של CatnB באמצעות אה-Cre (AC) או vil- Cre-ER T2 מערכת (DF). (A & D) סעיף H & E מראה אזורים של אובדן קריפטה; (ד לינה ו) הפסד להפגין קי-67 IHC של תאי שגשוג באמצעות T2 ויל-Cre-ER; (ו ג &) Olfm4 באתר מפגין נוכחות ISCs הפונקציונלי באמצעות אה-cre. לוח () -. (ו) שונה מן פארי ואח '16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: אפיון תאי פנט לאחר CatnB מחיקה באמצעות מערכות T2 ויל-Cre-ER ואה-Cre (AC):. תמונות Immunofluorescence של מאורות מראים תא פנט (אדום), B-קטנין (ירוק) וגרעין (כחול ), חץ מצביע קרום מחויב β-קטנין; (דה) IHC לcaspase-3 המציין תאים אפופטוטיים פנט נעדרים באה-Cre (ד) אך קיים במערכת T2 ויל-Cre-ER (ה). לוח (א) – (ה) שונה מפארי ואח '16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מאגר אצטט * * כדי להפוך 100 מיליליטר: 4.8 מיליליטר 0.2 M חומצה אצטית, 45.2 מיליליטר 0.2 M נתרן אצטט & 50 מיליליטר מים מזוקק חומצה אצטית פישר סיינטיפיק C / 0400 / PB17 אנהידריד אצטית סיגמא A6404 פתרון אנהידריד אצטית * * אנהידריד 2 M אצטית בhydrochloride 0.1 M triethanolamine Alcian הכחול סיגמא A5268 PH הכחול Alcian 2.5 * * </tד> מים 15 מיליליטר חומצה אצטית, 5 גרם Alcian Blue & 485 מיליליטר מזוקק: כדי להפוך את 500 מיליליטר phosphatase אלקליין אנטי digoxigenin נוגדן מצומדות Abcam ab119345 B (בטא) -Naphthoflavone סיגמא N3633 BNF, להזריק מבלי לאפשר הפתרון להתקרר יותר מדי כמתחם יירד מפתרון. פתרון יכול להיות שימוש – חנות ב -20 ° C בין שימושים, לא לחמם יותר מפעמיים. Bloxall מעבדות וקטור SP-6000 BM הסגול רוש 11442074001 ארגון ה- BSA סיגמא A4503 אלבומין בסרום שור כְּלוֹרוֹפוֹרם פישר סיינטיפיק C / 4920/17 ציטראט הצפת / Antigen הסרת מסכות פתרון מעבדות וקטור H-3300 שמן תירס סיגמא C8627 פתרון Demucifiying * * עבור 500 מיליליטר: 50 מיליליטר גליצרול, 50 מיליליטר טריס 0.1M pH8.8, 100 מיליליטר EtOH, 300 מיליליטר מלוח (0.9% NaCl במים), גרם DTT 1.7. פתרון Demucifying יכול להתבצע מראש ולאחסן, אבל DTT sholud יתווסף רק לפני הדגירה (340 מ"ג / 100 מיליליטר). טופל DEPC מים חיים טכנולוגיות 750,023 DTT סיגמא 101509944 EDTA סיגמא O3690 0.5 M אתנול פישר סיינטיפיק E / 0650DF / 17 נייר סינון וטמנתי 3000917 פורמלדהיד סיגמא F8775 פורמלין סיגמא SLBL11382V ניטראלי שנאגרו פורמלין פוראמיד סיגמא F5786 Glutaraldehye סיגמא G6257 H 2 O 2 סיגמא 216,763 Haematoxylin ריימונד כבש 12698616 HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2) מאגר הכלאה * * 5 × SSC, פוראמיד 50%, 5% SDS, 1 מ"ג / מיליליטר הפרין, 1 מ"ג / מיליליטר העגל tRNA כבד הידרוקינון סיגמא H9003 ImmPACT DAB Peroxidase מעבדות וקטור SK-4105 <tr> ערכת Immpress HRP אנטי עכבר IgG מעבדות וקטור MP-7402 ערכת IgG Immpress HRP נגד ארנב מעבדות וקטור MP-7401 אבקת רקמת מעי * * קרבים הקטנים של 5 עכברים בוגרים אוחדו, ומעוורים בהיקף המינימאלי של קרח הקר PBS. 4 כרכים של אצטון הקר כקרח נוספו למעי הומוגני, שהיה מעורב באופן יסודי וטופחו על קרח למשך 30 דקות. זה היה centrifuged והגלול נשטף באמצעות אצטון הקר כקרח. זה היה centrifuged נוסף וגלול וכתוצאה מכך התפשט על נייר סינון ולהתייבש. ברגע יסודיות לייבש את החומר טחון לאבקה דקה באמצעות מכתש ועלי. K-ferricyanide סיגמא P-3667 K-ferrocyanide סיגמא P3289 </tr> Levamisole סיגמא L0380000 Methacarn * * 60% מתנול: כלורופורם 30%: 10% חומצה אצטית מתנול פישר סיינטיפיק M / 4000/17 MgCl2 סיגמא M8266 עז בסרום נורמלי מעבדות וקטור S-1012 NGS סרום ארנבת רגיל Dako X0902 NRS NTMT * * 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס HCl, 50 מ"מ MgCl2, 0.1% Tween20, 2 מ"מ levamisole PAP עט וֶקטוֹר H-400 Paraformaldehyde סיגמא P6148 PBT * * 0.5 M NaCl, 10 מ"מ TrisHCL pH 7.5, 0.1% Tween 20 פניצילין / סטרפטומיצין Gibco 15140-122 solutiuon 100x. בופר פוספט (10x) פישר סיינטיפיק BP3994 Dilluted 1:10 עם מים מזוקקים לעשות 1x שקופיות PLL סיגמא P0425-72EA שקופיות מיקרוסקופ פולי-L ליזין Proteinase K סיגמא P2308 פתרון K proteinase * * לדלל proteinase K ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר ב 50 מ"מ טריס, 5 מ"מ EDTA. Ralwax BDH 36154 7N מפחית פתרון * * כדי להפוך 100 מיליליטר: 1 גרם הידרוקינון, sulphite נתרן 5 g & 100 מיליליטר מים מזוקקים RnaseA סיגמא R6148 </Td> מִלְחִית * * 0.9% NaCl במים מזוקקים SDS סיגמא I3771 סרום כבשים סיגמא S3772 כסף חנקה סיגמא S / 1240/46 פתרון כסף * * כדי להפוך 100 מיליליטר: 10 מיליליטר חיץ אצטט, 87 מיליליטר מים מזוקקים, 3 מיליליטר 1% כסף חנקה אצטט נתרן פישר סיינטיפיק S / 2120/53 נתרן כלורי סיגמא S6753 NaCl סולפיט נתרן סיגמא 239,321 SSC סיגמא 93,017 נתרן ציטרט המלוח 20x קלטת כירורגי פישר סיינטיפיק 12960495 טמוקסיפן סיגמא T5648 TAM, להזריק מבלי לאפשר הפתרון להתקרר יותר מדי כמתחם יירד מפתרון. פתרון יכול להיות שימוש – חנות ב -20 ° C בין שימושים, לא לחמם יותר מפעמיים. TBS / T איתות תא # 9997 הידרוכלוריד Triethanolamine סיגמא T1502 טריס-HCL Invitrogen 15567-027 Tween20 סיגמא TP9416 VectaMount מעבדות וקטור H-5000 Vectashield Hardset הרכבה בינוני עם DAPI מעבדות וקטור H-1500 Vectastain ערכת ABC Vectאו מעבדות PK-4001 X-gal Promega V3941 מקבע X-gal * * פורמלדהיד 2%, glutaraldehyde 0.1% ב1xPBS כתם X-gal * * כתם X-gal; X-gal 200 μl () ב 50 מיליליטר הפתרון B (.214 גרם MgCl2, K-ferricyanide 0.48 גר ', ז .734 K-ferrocyanide ב500 מיליליטר PBS). פתרון ב 'יכול להיות מורכב oin מראש ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס קסילן פישר סיינטיפיק X / 0200/21 טבלת 1: חומרים ושיטות יַעַד בטא-קטנין יזוזים Ki67 Caspase-3 Villin מקור מסחרי של Ab העיקרי מעבדות התמרה Neomarkers מעבדות וקטור מערכות מו"פ סנטה קרוז מספר קטלוג 610,154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672 העיקרי Ab גדל ב עכבר (מב) ארנב (PAB) עכבר (מב) ארנב (PAB) עיזים (PAB) אחזור Antigen אמבט מים רותח / ציטראט מאגר אמבט מים רותח / חיץ ציטראט אמבט מים רותח / חיץ ציטראט אמבט מים רותח / חיץ ציטראט אמבט מים רותח / חיץ ציטראט בלוק peroxidase H Bloxall או 2% שניות 2 O 2, 45 Bloxall או 1.5% H 2 O 2, 30 דקות Bloxall או 0.5% H 2 O 2, 20 דקות Bloxall או 2%H 2 O 2, 45 שניות Bloxall או 3% H 2 O 2, 20 דקות בלוק סרום BSA 1%, 30 דקות 10% NGS, 30 דקות 20 NRS%, 20 דקות 10% NGS, 45 דקות 10 NRS%, 30 דקות חיץ לשטוף PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T תנאים לAb העיקרי 1/300, שעה 2 ב RT 1/100, 1 שעות ב RT 1/50, 1 שעות ב RT 1/750, o / n על 4 מעלות צלזיוס 1/500, 1 שעות ב RT Ab המשני ערכת Immpress HRP אנטי עכבר IgG ערכת IgG Immpress HRP נגד ארנב ארנב Biotinylated אנטי-עכבר נגד ארנב Biotinylated עיזים ארנב Biotinylated אנטי-עז תנאים לAb המשני שעה 1 ב RT 30 דקות ב RT <t ד> 1/200, 30 דקות ב RT 1/200, 30 דקות ב RT 1/200, 30 דקות ב RT הגברה אות N / N / ערכת ABC ערכת ABC ערכת ABC גילוי אותות ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase נוגדן immunofluorescence Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / N / N / מאפייני immunofluorescence העירור מקס 488 / פליטת מקס 525 העירור מקס 595 / פליטת מקס 617 מערכת סינון נפוצה FITC טקסס אדומה תוכן "> טבלה 2: נוגדנים IHC ותנאים
Discussion
שימוש בעכברים הטרנסגניים Cre-לקס מותנים לנתח את הפונקציה של גנים ותאים הוא גישה נפוץ. מודלים אלה היו בשימוש בהצלחה רבה במעי לזהות ולאפיין את תאי גזע 2,4-6 ולהבין את תפקידם במחלה 25. כדי לנצל באופן מלא דגמים אלה מחייב אפיון מקיף של המערכת כדי לאפשר נתונים להתפרש בצורה נכונה. הבנה של מערכות אלה מלאים היא קשה להשגה בשל גנים לעתים רחוקות להיות ספציפיים לסוג תא בודד או מיקום, חוסר ידע וחוסר היעילות של המערכות המשמשות כדי לעודד ביטוי Cre ביולוגיים. השיטות שתוארו כאן להדגים כיצד אנו להתגבר על בעיות אלה באמצעות עיצוב ויישום של ידע הקיים ניסיוניים. למרות שאנו משתמשים בשיטות אלה כדי לענות על שאלת מחקר ספציפית הטכניקות מוצגות כאן הנן גנריים וניתן לנצל לכל מחקר חוקר את Muriמעי ne.
הכנת רקמת מעי
הצעד החיוני להבטחת תוצאות חזקות הוא הקצירה והעיבוד של הרקמות, אשר צריך להיות מעובד באופן פרוטוקולים וקיבעון בזמן דבק בקפדנות. נושאים כמו כמעט כל משמעותיים במורד הזרם ניתן לייחס לחפצים הקשורים לייבוש הרקמות החוצה ו / או קיבעון שלם. העיתוי הוא קריטי כדי למנוע השפלה של אדריכלות רקמות ו / או חומצות גרעין וחלבונים. קיבעון שלם או נלהב מדי יכול לגרום לאובדן של הרזולוציה histochemical. קיבעון שלם בשל זמן או חלקים עבים מדי כדי לאפשר חדירה מקבע יכולה לגרום לאובדן של רזולוציה בתוך מאורות המעי שיכול להיות שנצפו כ" סימן גאות "על ניתוח IHC מספיק. בהמשך זה קריטי, כי קיבעון לא להאריך יותר מדי זמן, כמו β-קטנין הגרעיני יכול לפזר מתוך הגרעין, אלא אם כן באופן מיידי פרוcessed והשעווה המוטבעת הבאים קיבעון פורמלין.
תפקיד של תאי פנט בנישת ISC
הנתונים המוצגים כאן ביעילות להראות את החשיבות של תאי פנט בהתחדשות קריפטה במעי המבוגר הבאה אובדן ISC. עם זאת נותר האפשרות שאה-Cre חוסך אוכלוסייה של ISCs שמטרות T2 ויל-Cre-ER. טיאן et al. 26 באלגנטיות הוכיח כי ISCs היי Lgr5 מוחלפים על ידי אוכלוסייה של ISCs המילואים Lgr5 lo. סביר להניח כי ISCs אלה חסכו במערכת אה-Cre בשל אוכלוסיית המילואים שזוהתה כמבשרי תא הפרשת 6,7 עכשיו. חשיבותו של תא פנט הבוגר בתמיכת מבשרי תא הפרשה אלה בעת הצורך לחזור למדינת ISC נותרת ענתה. כתאי פנט מהווים אניהנישה SC 8 ולשחק תפקידים בויסות תגובות ISC לצריכת קלוריות 27 ודלקת 28 הוא נשאר סביר להניח כי פונקציות הסיעוד שלהם תהיה להאריך למבשרים שלהם.
גישות וטכנולוגיות ליעילות המודל אנושי של סרטן המעי הגס חדשות
הגילוי של ISC הוביל לזיהוי של גנים עכשיו שנמצא בשימוש כדי ליצור מודלים עכבר חדשים לחקירה את התפקידים של גנים ותאים בביולוגיה מעיים ומחלות, נסקרה על ידי קלארק ואח '9. המגבלות רק לטכניקה זו היא זיהוי של גנים לבטא חלבון Cre. נכון לעכשיו ISCs באופן שיגרתי נחקר באמצעות עכברים הטרנסגניים מותנים המבוססים על תבנית ביטוי גני Lgr5. עכברים אשר מבטאים Cre מאמרגן Lgr5 שימשו למחוק APC, הגן שעבר מוטציה הנפוצה ביותר בסרטן מעי גס (CRC), הממחיש את ISC כתא ממוצא 25. סלקטיבי מחיקת גני CRC אחרים בתאים אלה מספק תובנה התקדמות מחלה והתפשטו לדוגמא. PTEN 29. תובנה נוספת לתוך פונקצית ISC מתבצעת תוחזר על ידי ablating במיוחד Lgr5 -expressing תאים בעכברים באמצעות קולטן רעלן דיפתריה האנושית גן (DTR) דפק לLgr5 לוקוס 26. אסטרטגיות אחרות להשתמש במערכת ט-O המאפשרת ביטוי הפיך מתמשך של חלבוני מוטציה 30. שימוש בכלים אלה כדי לשנות גן (ים) בתאים שונים ובמקומות 31 32,33 משמש כדי להבין איך הסרטן ליזום, התקדמות ולשלוח גרורות 34. לחלופין mutagenesis באמצעות מערכת transposon יופי השינה הוא זיהוי נהגים חדשים של CRC. הפיתוח המתמשך של עכברים, טכניקות ואסטרטגיות שינוי גנטיות ממשיך לפתח מודלים רלוונטיים יותר סבלניים.
מ 'חדשethods פותחו לאפיון של epithelia וISCs המעיים. אפיון של היחס של סוגי תאי האפיתל יכול להיות מושגים באמצעות זרימה מבוסס cytometry על ביטוי ההפרש של קטינים ו -35 CD24. פוטנציאל ההתקדמות הגדולה ביותר בביולוגיה ISC ההבנה ותפקידם במחלה ייעשה באמצעות לשעבר vivo organoid מערכת תרבות 36. מערכת זו מאפשרת ISCs הנורמלי וממאירים לתרבות ב3D, שבו הם לשכפל ולהבדיל באופן יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. יש לקוות כי אלה יאפשר בדיקה ישירה של תרופות על דגימות מטופל במבחנה, סוללים את הדרך לרפואה מותאמת אישית 37.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood and Sylvie Robine. This work was funded by a programme grant from Cancer Research UK.
Materials
| Acetate buffer | * | * | To make 100ml: 4.8ml 0.2M Acetic acid, 45.2ml 0.2M Sodium acetate & 50ml distilled water |
| Acetic acid | Fisher Scientific | C/0400/PB17 | |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | |
| Acetic anhydride solution | * | * | 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride |
| Alcian Blue | Sigma | A5268 | |
| Alcian Blue ph2.5 | * | * | To make 500ml: 15ml acetic acid, 5g Alcian Blue & 485ml distilled water |
| anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody | Abcam | ab119345 | |
| B(beta)-Naphthoflavone | Sigma | N3633 | BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice. |
| Bloxall | Vector Labs | SP-6000 | |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| BSA | Sigma | A4503 | Bovine serum albumin |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4920/17 | |
| Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution | Vector Labs | H-3300 | |
| Corn oil | Sigma | C8627 | |
| Demucifiying solution | * | * | For 500ml: 50ml glycerol, 50ml Tris 0.1M pH8.8, 100ml EtOH, 300ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7g. Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340mg/100ml). |
| DEPC treated water | Life Technologies | 750023 | |
| DTT | Sigma | 101509944 | |
| EDTA | Sigma | O3690 | 0.5M |
| Ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | |
| Filter paper | Whatman | 3000917 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formalin | Sigma | SLBL11382V | Neutral buffered formalin |
| Formamide | Sigma | F5786 | |
| Glutaraldehye | Sigma | G6257 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | |
| Haematoxylin | Raymond A Lamb | 12698616 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | HBSS (-MgCl2+; -CaCl2) |
| Hybridisation buffer | * | * | 5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Labs | SK-4105 | |
| Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit | Vector Labs | MP-7402 | |
| Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit | Vector Labs | MP-7401 | |
| Intestinal tissue powder | * | * | The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 minutes. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. |
| K-ferricyanide | Sigma | P-3667 | |
| K-ferrocyanide | Sigma | P3289 | |
| Levamisole | Sigma | L0380000 | |
| Methacarn | * | * | 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/17 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | S-1012 | NGS |
| Normal rabbit serum | Dako | X0902 | NRS |
| NTMT | * | * | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole |
| PAP pen | Vector | H-400 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBT | * | * | 0.5M NaCl, 10mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x solutiuon. |
| Phosphate buffered saline (10x) | Fisher Scientific | BP3994 | Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x |
| PLL slides | Sigma | P0425-72EA | Poly-L-lysine microscope slides |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Proteinase k solution | * | * | Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA. |
| Ralwax | BDH | 36154 7N | |
| Reducer Solution | * | * | To make 100ml: 1g Hydroquinone, 5g sodium sulphite & 100ml distilled water |
| RnaseA | Sigma | R6148 | |
| Saline | * | * | 0.9% NaCl in distilled water |
| SDS | Sigma | I3771 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Silver nitrate | Sigma | S/1240/46 | |
| Silver solution | * | * | To make 100ml: 10ml Acetate buffer, 87ml distilled water, 3ml 1% silver nitrate |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S/2120/53 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S6753 | NaCl |
| Sodium sulfite | Sigma | 239321 | |
| SSC | Sigma | 93017 | 20x saline sodium citrate |
| Surgical tape | Fisher Scientific | 12960495 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20°C between uses, do not reheat more than twice. |
| TBS/T | Cell Signalling | #9997 | |
| Triethanolamine hydrochloride | Sigma | T1502 | |
| Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | |
| Tween20 | Sigma | TP9416 | |
| VectaMount | Vector Labs | H-5000 | |
| VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Labs | PK-4001 | |
| X-gal | Promega | V3941 | |
| X-gal fixative | * | * | 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1xPBS |
| X-gal stain | * | * | X-gal stain; 200ul X-gal (A) in 50ml solution B (0.214g MgCl2, 0.48g K-ferricyanide, 0.734g K-ferrocyanide in 500ml PBS). Solution B can be made up oin advance and stored at 4°C |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0200/21 |
References
- Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Clevers, H. . The gut, a clonal conveyor belt. , (2015).
- Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
- Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
- Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
- Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
- Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
- Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
- Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
- Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
- Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
- Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
- Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
- Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
- Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
- Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
- Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
- Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
- Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
Cite This Article
Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).