Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

1. Química Acoplamiento de proteínas de perlas de polímero Acoplamiento direccional tiol-amina Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de la cisteína que contiene proteínas para funcionalizada con amina perlas de polímero, utilizando sulfosuccinimidilo 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulación (Figura 1). Figura 1. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-amina direccional de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno modificadas con amina se activan con sulfo-SMPB. La maleimida reacciona con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de reactivos: Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave. </li> Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS) de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) inmediatamente antes de su uso. Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH 2 O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso. Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de cisteína inmediatamente antes del uso. La activación del grano: Mezclar la suspensión de perlas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte. Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado. Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS. Añadir 200 ml de recién preparada 10 mM sulfo-SMPB, para dar una concent definitivaración de 2 mM. Se incuba la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria. Reducción de Proteínas: Durante el período de incubación de la etapa de activación, preparar la proteína para la siguiente etapa de acoplamiento para que pueda ser inmediatamente añadió a las perlas activadas. Nota: Aunque este paso de reducción no siempre es necesaria para la GST (glutatión S-transferasa) proteínas de fusión, se recomienda para asegurar una alta eficiencia de acoplamiento. Comprobar la concentración de proteína, y ajustarlo a la concentración final requerida para la reacción de acoplamiento. Nota: proteína de 6 mM en PBS, y un volumen de 1 ml se utilizan generalmente. Añadir TCEP acciones para dar una concentración final de 5 mM. Incubar la solución durante 30 min a RT. Nota: La mezcla de reacción se puede utilizar directamente para la siguiente reacción de acoplamiento. Conserve una pequeña cantidad (unos pocos ml) de la solución de proteína para determinar la pro concentración de proteína y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2). Proteína etapa de acoplamiento: Sedimentar las perlas activadas mediante centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga), y lavar el pellet una vez en 1 ml de PBS estéril fresco. Resuspender el precipitado en la solución de proteína preparada (por ejemplo, 1 ml), para dar la concentración deseada de proteína. Nota: La concentración de proteínas durante la etapa de acoplamiento dependerá de la eficacia de acoplamiento medio (ver sección 2 para la determinación de la eficacia de acoplamiento) y la densidad de acoplamiento deseado (como se calcula en 1.1.4.3). La eficiencia es de aproximadamente 85% y de la deseada concentración final 5 mM en la suspensión 10x del grano, por lo que la concentración de proteína durante la etapa de acoplamiento debe ser de aproximadamente 6 mM. Calcular la densidad de acoplamiento usando la siguiente fórmula: jpg "/> donde densidad de acoplamiento ρ c [número de moléculas de proteína / nm 2], concentración de proteína concentrada de proteínas [mg / ml], proteína M w peso molecular de proteínas [Da], concentración concentrado grano del grano [número de cuentas / L], diámetro del grano d [nm 2] El número de Avogadro Utilice la densidad de acoplamiento para calcular la separación media ligando: Se incuba la suspensión de proteína-grano durante 2 horas a 25 ° C en una rueda giratoria. Nota: Algunosproteínas pueden no ser estable a temperatura ambiente. En estos casos, la reacción puede llevarse a cabo a 4 ° CO / N. Desactivar restantes grupos activados en las perlas mediante la adición de cisteína de stock a una concentración final de 50 mM y se incuba la suspensión durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria. Sedimentar las perlas por centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga). Mantenga el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2). Lavar el sedimento de perlas dos veces con 1 ml de PBS y se resuspenden en 1 ml de PBS fresco para dar el producto final. Nota: El protocolo anterior será típicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a una concentración final de proteína de 5 mM, que se puede utilizar como un stock de 10x para experimentos posteriores (véase la sección 3). Para proceder a la sección 3 del protocolo, trabajar con 100 ml / ml de grano de valores, o a una concentración final de 500 nM de proteína. Nota: Un buen punto de partida para este procedure será de 2 × 10 12 perlas / ml, lo que resulta en una densidad de acoplamiento promedio de 3 × 10 -4 proteínas / NM 2 o un espaciamiento promedio de 57 nm sobre una perla de 2 mm de diámetro. Acoplamiento direccional tiol-carboxi Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de cisteína que contiene proteínas a perlas de poliestireno funcionalizado con carboxilo. El resto carboxilo se activa por primera vez el uso de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS), amina modificada y luego reticulado usando sulfo-SMPB (Figura 2). Figura 2. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-direccional carboxilo de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno carboxilado son activados primero con EDC y modificados con NHS para formar un éster de NHS-semi-estable. Con posterioridad amina de acoplamiento de etilendiresultados de amina en un grupo amina libre, que reacciona con sulfo-SMPB. Maleimida activa perlas entonces pueden reaccionar con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de reactivos: Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave. Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS,) de TCEP inmediatamente antes del uso. Preparar una 10x de stock (20 mM, o 4 mg / ml en PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) inmediatamente antes de su uso. Preparar una 10x de stock (50 mM, o 6 mg / ml en PBS) de NHS (N-hidroxisuccinimida) inmediatamente antes de su uso. Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH 2 O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso. Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de la cisteína inmediatamente buso ntes. La activación del grano: Mezclar la suspensión de microesferas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte. Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado. Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS. Añadir 100 ml de 10x EDC social (2 mM concentración final) y de inmediato 100 ml de solución madre 10x NHS (5 mM concentración final) para la suspensión de perlas. Se incuba la suspensión de microesferas durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria. Lavar perlas una vez en 1 ml de PBS y se resuspenden en 0,8 ml de PBS estéril fresco. Añadir 200 ml de etilendiamina, y incUbaté la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria. Lávese las cuentas una vez con PBS 1 ml y resuspender las perlas en 0,8 ml de PBS fresco. Proceda de la sección 1.1.2.4 (activación de cuentas con sulfo-SMPB) como se describe en la sección 1.1.2 y seguir el resto del protocolo descrito en la sección 1.1 (acoplamiento direccional Tiol amina). Realizar preparación de proteína y los pasos de acoplamiento de proteínas de una manera idéntica a las descritas en la sección 1.1. Nota: La eficacia de acoplamiento típica usando este protocolo es ligeramente inferior en comparación con la sección 1.1, por lo tanto, ajustar la concentración inicial de proteína en consecuencia para conseguir la misma densidad de acoplamiento (75% aprox.). 2. Determinación de la eficiencia de acoplamiento Nota: Para determinar la concentración de proteína, utilizar Bradford Reactivo 10 y ensayos colorimétricos como sigue: Invierta suavemente Bradford reactivo al correo Nsure homogeneidad del reactivo. El uso de una solución madre de BSA 10 mg / ml, se preparan patrones de proteínas que cubren las concentraciones a partir de 0,1 a 1,5 mg / ml de BSA en tampón. Añadir 250 ml de reactivo de Bradford a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Preparar suficientes pozos para todas las muestras, estándares de proteína y controles negativos (tampón solamente). Añadir 5 ml de muestra de proteína (estándares de proteína o tampón, para el control negativo) con el reactivo en la placa de 96 pocillos. Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 10 min. Medir la absorbancia a 595 nm usando un lector de placas. Generar una curva estándar de la concentración de BSA en comparación A595 nm y utilizar esto para determinar concentraciones de proteína en las muestras iniciales y el sobrenadante. Calcular la concentración de proteína acoplada como sigue: Calcular la eficiencia de acoplamiento como: 00eq4.jpg "/> 3. El uso de acoplado Bead Adhesinas en ensayos de competición Preparación: Semilla de 1 ml por pocillo de células Hela a una concentración de 150.000 células / ml en una placa de 24 pocillos el día antes de que el ensayo de competición, para permitir que las células alcanzan aproximadamente 80% de confluencia antes de iniciar el experimento. Configure cada condición experimental por triplicado. Incluya pozos para controles negativos (sin bacterias añadidas durante ensayos de competición), controles positivos (perlas de control junto a la fusión etiqueta única añadida durante ensayos de competición) y controles de lisis (para experimentos de citotoxicidad). Inocular un LB (MLB) cultivo de 5 ml marina con una colonia fresca de V. parahaemolyticus y crecer O / N a 30 ° C, agitando. Preparar suficiente MAM grano acoplados, como se describe en el apartado 1. (Coupling). Permitir 100 ml de 10x grano Stock por pocillo. Ensayo de competición: En el día de la competención experimento, medir el diámetro exterior 600 del cultivo bacteriano. Preparar los medios de comunicación la infección mediante la dilución de cultivos bacterianos en DMEM sin color y sin aditivos, pre-calentado a 37 ° C, que contiene un 10% de suspensión / v del grano v (ya sea adhesina acoplados a perlas o cuentas de control), para dar una MOI de 10. Prepare 1 ml / pocillo y 10-20% exceso de volumen por muestra. Nota: Para las condiciones antes mencionadas (placas de 24 pocillos, V. parahaemolyticus, MOI 10), el volumen necesario de la cultura de O / N que se añade por pozo (ml / ml) se calcula como 3 / OD 600 de la cultura. Por ejemplo, 1 ml de medio de infección se suelen contener 100 ml suspensión de perlas, unos pocos ml de cultivo bacteriano y se efectuarán hasta 1 ml con color, DMEM sin suplementar. Eliminar el medio viejo de los pocillos y lavar las células Hela cultivadas mediante la adición de 1 ml de PBS estéril pre-calentado a 37 ° C a cada pocillo. Retire PBS y añadir 1 ml de medio de infección por pocillo. También establecer controles, añadiendo soluciones containing bolas de control y bacterias (control positivo) o perlas de adhesina y no hay bacterias (controles negativos), o DMEM que contenía Triton X-100 (control de lisis, sólo es necesaria para mediciones de citotoxicidad) 0,1%. Incubar la placa en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C durante la cantidad de tiempo deseada (por ejemplo, 4 hr para las mediciones de citotoxicidad o 1 hr para las mediciones de adhesión). Nota: Tanto la adhesión bacteriana y la citotoxicidad en células huésped se pueden utilizar como-outs para leer la eficacia de la inhibición. Si los puntos de tiempo de las mediciones de citotoxicidad y de adhesión coinciden, ambos ensayos se pueden realizar utilizando muestras del mismo pozo, ya que la citotoxicidad se determina usando los ensayos de sobrenadante de cultivo y de fijación utilizan muestras derivadas de la capa de células restante. Mediciones de citotoxicidad: En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 4 horas), retire tres veces 200 ml de cada 24 pocillos y trasladouna placa de 96 pocillos. Haga girar las placas de 96 pocillos a 1.500 xg, 5 min y transferencia de 100 ml de cada pocillo en una placa de 96 pocillos fresco. Añadir 100 ml de los medios de comunicación utilizados durante la infección experimentos a pozos frescos de la placa de 96 pocillos por triplicado (éstos serán utilizados como espacios en blanco). Llevar a cabo el ensayo deshidrogenasa (LDH) liberación de lactato utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH y siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, el cálculo de la cantidad de reactivo necesario en incrementos de 25 (por ejemplo, si 62 muestras se van a medir, conforman mezcla de reactivos suficientes para 75 etc.). Por ejemplo, para 100 muestras, mezclar 11,25 ml de reactivo A con 250 l de reactivo B. Invertir, no hacer vórtice para evitar la formación de espuma. Ponga la mezcla en un depósito para ser capaz de pipetear con una pipeta multicanal. Añadir 100 l de mezcla de reactivos a cada muestra. Incubar la placa a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 490 nm en un lector de placas a 10, 20, 30 min. </li> Analizar el conjunto de datos para el que la absorbancia de la muestra de control de lisis es alto, pero aún dentro del rango lineal del lector de placas (por lo general, 2-3 unidades de absorbancia). Expresar los resultados como% de citotoxicidad, utilizando la siguiente fórmula para la conversión: Medición de la adhesión bacteriana: En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 1 hora), quitar el medio de la capa de células. Lave bien la capa de células con estéril, PBS precalentado (al menos 3-4 lavados de 1 ml de PBS cada uno) para eliminar cualquier célula-un adjunto. Células anfitrionas Lyse mediante la adición de 1 ml de una 1% v / v estéril Triton X-100 en PBS solución por pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 min. Pipetear cada muestra arriba y abajo varias veces antes de transferir el contenido de cada pocillo para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 veces diluciones seriadas de las muestrasen PBS estéril (por ejemplo, utilizar 100 ml de muestra y 900 ml de PBS). Placa 100 ml de cada muestra en agar MLB y difundir el uso de un esparcidor de células. Optimizar que diluciones a la placa en función de las cepas bacterianas y punto de tiempo. Nota: Para la configuración experimental descrito, 10 5 o 10 6 diluciones dan un número adecuado de UFC. Incubar las placas a 37 ° CO / N y enumerar las bacterias por recuento de colonias.