Биомиметические Материалы для характеристики Бактерии-хозяин взаимодействий
Summary
Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Abstract
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Introduction
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем два протокола, которые могут быть использованы для соединения тиолсодержащих белков аминов или карбоновых кислот, модифицированный полистирольных шариков, соответственно. Благодаря легкости процедуры, соединительный тиол-амин является предпочтительным, но в зависимости от желаемой спецификации шарик (диаметр, свойства флуоресценции), использование аминных функционализированных шариков не может быть возможным, и мы поэтому включены протокол, который будет преобразовывать карбоксилат – в остатке амина, чтобы дать исследователю максимальную гибкость в выборе эшафот. Хотя оба тиол-амин и тиол-карбоксильной муфты работа для любого цистеина, содержащего белок, направленное сцепление (то есть, иммобилизация белка на его N-конце, имитируя поверхность дисплея) требует белка без цистеиновых остатков, которые получают в виде GST синтеза белок, или который содержит один терминал остаток цистеина введен сайт-направленного мутагенеза. Если несколько реактивных цистеина содержитсяв белке, это приведет к случайным иммобилизации, которые могут препятствовать функции белка. Многие бактериальные Адгезины не содержат цистеина, естественно. Для других они могут быть удалены с помощью сайт-направленного мутагенеза, хотя это потребует обширных анализов для обеспечения естественной структурой и функцией, сохраняются в мутанте. Для слитых белков GST, очищенный GST-метка в сочетании с гранулами можно использовать в качестве подходящего отрицательного контроля. Используя несвязанных бусы в качестве контроля следует избегать, так как они часто имеют более высокую склонность к комкованию или присоединиться к клеток неспецифически. Упрощенный вариант протокола 1,2., Используя только EDC, может быть использован для соединения с карбоксильными белков функционализированных полимерных гранул, однако в этом случае муфта проходит через первичные амины в белке, и поэтому не гарантирует направленного муфту.
ТСЕР в качестве восстанавливающего агента, не должны быть заменены другими коммерчески доступными и обычно используемых восстанавливающих агентов, таких как dithiothreitol (ДТТ) или 2-меркаптоэтанол (ВМЕ), как тиолы, содержащиеся в них будет конкурировать с связывающих белки в тиол-малеимид стадии конденсации. PBS может быть заменен другими буферами, но с учетом следующих соображений: Буферы могут не содержать первичные амины (так Трис-буферы, содержащие не подходят). Использование буферов, содержащих очень низкие (<10 мм) концентрации соли приводит к борту комков, а также следует избегать. Чистота Белок является также важным фактором во время этой процедуры, и для достижения высококачественных данных, чистые белки должны быть использованы. Мы регулярно очистки белков в несколько стадий, в том числе по меньшей мере на этапе аффинной очистки и гель-фильтрации, но в некоторых случаях ионообменной хроматографии, как это делается на третьей стадии. В результате чистота белков, используемых для соединения, как правило, 90% или выше, о чем судили по SDS-PAGE.
Рекомендуется для определения концентрации белка и в исходном реакционной смеси, а также гое супернатант после завершения реакции. Это поможет определить кажущуюся концентрацию шарик связью белка, и, следовательно, плотность сцепления. Определение обоих значений также позволит Расчет эффективности связи. Это может быть принято во внимание при подготовке исходного раствора белка в последующих реакциях, чтобы достичь желаемой конечной концентрации, и соединительный плотность. Брэдфорд реагент особенно подходит для определения концентрации белка до и после реакции сочетания, поскольку ни один из веществ в реакции не мешает образованию комплекса красителя в концентрациях, используемых. Если более низкие концентрации белка, которые будут использоваться, этот метод может должны быть заменены более чувствительный метод обнаружения, однако внимание следует обратить на то, что должен быть совместим с веществами, содержащимися в реакции сочетания. Также рекомендуется использовать свежеприготовленные реагенты и обрабатывать порошкообразные реагенты с осторожностью (например, магазинв герметичном контейнере и использовать шарики кремнезема, чтобы избежать реагенты извлекает влагу), так как качество реагентов будут влиять на эффективность связывания. Если эффективность сочетания ниже, чем ожидалось, возможные способы устранения включают в себя увеличение начальных шарик и концентрации протеина. Если используются более высокие концентрации, концентрация реагентов сочетания должна быть увеличена пропорционально, чтобы обеспечить достаточную молярного избытка. Изменение концентрации шарик / белок, как правило, лучше шаг к оптимизации, а не увеличения времени реакции. Поскольку протоколы борта связи являются длительными, мы обычно готовят крупную партию материала. Аликвоты суспензии можно быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -20 ° С в течение нескольких месяцев. Размороженные аликвоты не следует замораживать и должны храниться при температуре 4 ° С и использовали в течение 1-2 дней. Однако, это будет варьироваться в зависимости от характера и стабильности белка, используемого в качестве должны быть проверены на небольшой партии изначально.
<p class = "jove_content"> бисера-сочетании Адгезины могут быть использованы для многих приложений, как описано ниже. Этот протокол описан анализ, который обычно используется для измерения ингибирования бактериального связывания и патогенных опосредованной цитотоксичности на клетках-хозяевах. Анализ обычно проводится для измерения потенциала борта связью MAMS конкурентно ингибировать инфекцию Hela эпителиальных клеток с морской пищевыми патогена Vibrio parahaemolyticus, с использованием либо уменьшение прикрепление бактерий к клеткам-хозяевам или уменьшить цитотоксичность в считывани , В обоих случаях, подготовка и конкуренции анализы следовать тот же протокол. В зависимости от считывания, различные штаммы V. parahaemolyticus используются: цитотоксическое напряжение POR1 используется для измерения цитотоксичности, в то время как не-цитотоксических штамм POR2 используется для измерения адгезии бактерий, так как гибель клеток и клеток отряд компрометирует процедуру количественного прикрепленные бактерии.Первоначально Compeренции были поставлены опыты в ступенчатом протокола, где клетки-хозяева были сначала предварительно инкубировали с бусами перед добавлением бактерий. Для В. parahaemolyticus и спецификации шарик используемые (2 мкм шарики, соединенные с MAM7), оба шарики и бактерии могут быть добавлены одновременно без изменений в результате цитотоксичности. Т.е., в этом экспериментальной установки, шарики вытеснить бактерии для связывания клетка-хозяин. В зависимости от геометрии видов бактерий и шарик, используемой, может быть хорошие причины для поддержания адгезии шарик и бактериальную инфекцию, как две отдельные стадии. Например, чтобы инфицировать клетки с неподвижных бактерий, пластины обычно центрифугировали после добавления инфекции сред. Тем не менее, центрифугирование чашках, содержащих шарик суспензии следует избегать, так как это приводит к весьма неравномерного распределения шариков на клеточный слой. Если используются меньшие размеры частиц, бусы займет больше времени, чтобы поселиться на поверхности клеток, в этом случае суfficient время должно быть разрешено для крепления борта до заражения. При бактериальной адгезии используют в качестве считывать, образцы должны быть приняты в моменты времени, когда клетки-хозяева, существенно не повреждены заражение штаммом, а открепления клеток и лизиса может поставить под угрозу количественное прикрепленных бактерий.
Вместо перечисления адгезию бактерий разрежающим покрытия, образцы альтернативно может быть обработан для получения изображений (рисунок 5). В этом случае культуры тканей должно быть высевали стекла покровные стекла, а не непосредственно в лунки. Кроме того, могут быть использованы флуоресцентные шарики и бактерии, экспрессирующие флуоресцентный белок, наряду с инфекцией специфических маркеров клеток-хозяев. Например, конкуренция эксперименты обычно изображается с помощью флуоресцентного красного родамин-фаллоидина окрасить актина цитоскелета клетки-хозяева "The и оценить морфологические изменения, обусловленные инфекцией, вместе с люминесцентными синий бисер и люминесцентныезеленый (GFP выражения или SYTO18 окрашенных) бактерии.
Диапазон борта связью адгезинов, в том числе золотистый стафилококк FnBPA, Streptococcus Пирролидонилпептидаза F1 FUD и Vibrio parahaemolyticus МАМ, были использованы в качестве биомиметических материалов для изучения адгезии, торможение прилипания и вклад адгезии к патоген-опосредованной цитотоксичности 1, 7, 8. Одним из преимуществ использования такого подхода является простота визуализации событий крепления, так как полимерные гранулы, используемые в качестве строительных лесов доступны в широком диапазоне цветов (например, синего, красного флуоресцентного, синий, зеленый, оранжевый). Таким образом, маркировка прямой белок, который может помешать функции, можно избежать. Кроме того, поверхность муфты имитирует поливалентный отображение адгезинов на бактериальной поверхности, таким образом, отражает более физиологически соответствующие конформации по сравнению с растворимых белков.
По сравнению с использованием неповрежденных исследований бактерии или bacteriаль-мутанты, подход шарик обходит проблемы, связанные с бактериального роста. Например, долгосрочные (например, O / N), исследования бактериальной адгезии к клеткам-хозяевам, используя нетронутыми бактерии часто скомпрометирована явлений, сопровождающих рост бактерий – подкисление истощения среднего роста и питательных веществ негативно влияет на клетки-хозяева и бактериальные репликации в конечном итоге ставит под угрозу качество изображения.
Совсем недавно, использование бортовых связью адгезинов была расширена, чтобы включить их использование в качестве инструмента для аффинной очисток принимающих сотовой факторов, участвующих в процессах ниже по течению бактериального прикрепления сигнализации. В. parahaemolyticus MAM7, путем связывания с фосфатидные кислоты в клетке-хозяине мембраны, вызывает RhoA активацию и актина перестановки 1, 3. МАМ связью шарики, которые используются для очистки и идентификации белков, участвующих в платформах сигнальных собранных в результате МАМ-клетки-хозяина связывания. Так шарики могутлегко отделить от супернатанта стадией короткого центрифугирования, и интересующий белок ковалентно связан, это хороший способ для достижения отделение от примесей белков и обогащать соответствующие белковые комплексы, которые могут быть использованы для последующих применений, таких как протеомики или Западной истребив учением бывшее о.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Materials
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
