仿生材料表征细菌宿主相互作用

蛋白质1.化学偶联聚合物微球巯基胺定向耦合注意：此协议是适用于包含蛋白质胺官能化聚合物珠粒，使用磺基琥珀酰亚胺4-（对-maleimidophenyl）丁酸酯（磺基SMPB），为交联剂（图1）的半胱氨酸偶联。 图1.交联用于蛋白质的定向硫醇-胺偶联到聚合物珠的策略。胺改性的聚苯乙烯珠粒激活与磺基SMPB。马来酰亚胺反应了免费的半胱氨酸以定向耦合蛋白珠。 请点击此处查看该图的放大版本。 制备试剂的： 制备的PBS（100mM磷酸钠，150mM的氯化钠，pH值7.0）和高压釜中。 </l我> 在即将使用前制备100倍的股票的TCEP（0.5M或287毫克/毫升在PBS中）（三（2-羧乙基）膦）。 准备5倍的股票磺基SMPB（10毫米或4.58毫克/毫升卫生署2 O）在使用前。 准备了10倍的库存（500毫米或88毫克/毫升在PBS，pH 7.0）中的半胱氨酸即将使用前。 珠激活： 轻轻倒转混合珠悬浮液和所需珠悬浮液（例如，12ml）中的量转移到无菌1.5毫升管含1ml无菌PBS，pH为7.0。 轻轻吸液管上下离心在离心（16,000 XG 2分钟）洗珠和沉淀。 小心取出用吸管，弃去上清液。重悬沉淀珠在1ml新鲜无菌PBS，并重复洗涤步骤。重悬珠颗粒0.8毫升的PBS。 加200毫升新制备的10mM磺基SMPB的，得到最终concent日粮2毫米。 孵育珠悬浮液1小时，在25℃在旋转轮。 蛋白降低： 在活化步骤中的潜伏期，制备该蛋白质为以下偶合步骤，以便可以立即加入到活化的珠子。 注意：虽然此还原步骤并不总是需要的GST（谷胱甘肽S-转移酶）融合蛋白，建议以确保高耦合效率。 检查蛋白质浓度，并调整到所需的偶联反应中的最终浓度。注意：6毫蛋白在PBS中，并以1毫升的体积，通常使用。 添加TCEP库存，得到5mM的终浓度。孵育在室温30分钟的溶液中。 注意：反应混合物可直接用于下面的偶联反应。 保留蛋白质溶液少量（几毫升），用于确定亲蛋白浓度和耦合效率计算（见第2节）。 蛋白质偶合步骤： 沉淀活化珠通过离心（2分钟，16000×g离心在微量），并在1毫升新鲜无菌PBS洗涤沉淀一次。 重悬沉淀制备的蛋白质溶液（如1毫升）中，以得到所需蛋白质浓度。 注意：在偶联步骤中的蛋白质浓度将取决于平均耦合效率（参见测定偶联效率的第2部分）和所需的耦合密度（如计算1.1.4.3）。效率约为85％，和所需的最终浓度5mM的在10倍的珠悬浮液，所以在偶联步骤蛋白质浓度应为约6毫米。 使用下列公式计算的耦合密度： JPG“/>其中 ρC偶联密度[蛋白质分子数/纳米2]， 蛋白质浓蛋白质浓度[毫克/毫升]， 蛋白质男女蛋白分子量[大] 珠浓珠浓度[珠数/ L] ð珠径[纳米2] 阿伏伽德罗数使用耦合密度计算平均配体间距： 孵育该蛋白质 – 珠悬浮液2小时，在25℃在旋转轮。 注意：有些在RT蛋白可能不稳定。在这些情况下，反应可在4℃CO / N。 停用剩余的活化的基团上的小珠通过将半胱氨酸股票的50mM的终浓度和孵育悬浮液30分钟，在25℃在旋转轮。通过离心（2分钟16,000 XG在微量）沉淀珠。 保留上清用于确定蛋白质浓度和耦合效率计算（见第2节）。 在1ml与1ml的PBS重悬洗两次珠粒料新鲜的PBS，以得到最终产物。 注：上述协议通常给予1 ml的偶联蛋白质，在5mM的蛋白质终浓度，这可被用作一个10倍的库存为随后的实验（见第3节）。 要继续协议第3条，工作与珠的股票为100毫升/毫升，或500纳米的蛋白质终浓度。注：一个很好的起点为这个再修改则e会是2×10 12珠/毫升，产生3×10 -4的蛋白质/ nm 2的平均密度耦合或57纳米的上的2毫米直径的珠的平均间距。 巯基羧基定向耦合注意：此协议是适于耦合含有蛋白质羧基官能化聚苯乙烯珠半胱氨酸。羧基部分第一次被激活使用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）/ N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），胺改性，然后交联使用磺基SMPB（ 图2）。 图2.交联用于蛋白到聚合物珠的定向硫醇羧基偶联策略。羧基聚苯乙烯珠粒首先激活用EDC和改性NHS以形成半稳定NHS-酯。乙基二的后续胺耦合胺的结果在自由胺基，它可与磺基SMPB。马来酰亚胺激活，则珠可以免费半胱氨酸反应，定向耦合蛋白珠。 请点击此处查看该图的放大版本。 制备试剂的： 制备的PBS（100mM磷酸钠，150mM的氯化钠，pH值7.0）和高压釜中。 制备100倍的股票即将使用之前的TCEP（0.5M或287毫克/毫升在PBS中，）。 准备了10倍的库存中（20mM，或4mg / ml，在PBS中）的EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）在即将使用前。 准备了10倍的库存（50毫或6毫克/毫升在PBS中）的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）在使用前立即。 准备5倍的股票磺基SMPB（10毫米或4.58毫克/毫升卫生署2 O）在使用前。 立即b制备半胱氨酸的10倍的库存（500毫米或88毫克/毫升在PBS，pH 7.0）中安伏使用。 珠激活： 混合珠悬浮液轻轻倒转和所需珠悬浮液（例如，12ml）中的量转移到无菌1.5毫升管含1ml无菌PBS，pH为7.0。 轻轻吸液管上下离心在离心（16,000 XG 2分钟）洗珠和沉淀。 小心取出用吸管，弃去上清液。 重悬沉淀珠在1ml新鲜无菌PBS，并重复洗涤步骤。 重悬珠颗粒0.8毫升的PBS。 加入100毫升10倍EDC股票（2毫米终浓度），并立即百毫升10倍NHS原液（5毫米终浓度）至珠悬浮液。 孵育珠悬浮液30分钟，在25℃下在旋转的轮子。 于0.8ml新鲜无菌PBS于1ml PBS中重悬的一次洗珠。 加200 ml的乙二胺和增量乌瓦特珠悬浮液1小时，在25℃在旋转轮。 用1ml的PBS洗涤一次珠子和重悬珠子在0.8毫升新鲜的PBS。 从第1.1.2.4（珠活化硫代SMPB）根据第1.1.2所述继续并按第1.1（巯基胺定向耦合）描述的协议的其余部分。在相同的那些部分1.1中描述的方式执行的蛋白制剂与蛋白质偶联步骤。 注意：使用此协议的典型耦合效率略低相比第1.1节，因此调整初始蛋白质浓度相应地达到同样的耦合密度（约75％）。 2.确定耦合效率注意：要确定蛋白质浓度，使用Bradford试剂10和比色分析如下： 轻轻倒转Bradford试剂到e试剂的nsure均匀性。 使用10毫克/毫升BSA原液，制备蛋白质标准覆盖的浓度为0.1至1.5毫克/毫升BSA的缓冲液中。 加入250 ml的布拉德福德试剂向96孔板的孔中。准备足够的井所有的样品，蛋白质的标准和阴性对照（只缓冲）。 加入5 ml的蛋白质样品（蛋白质标准或缓冲器，用于阴性对照）在试剂中的96孔板中。 孵育板在定轨摇床上在室温下进行10分钟。 用酶标仪测定吸光度在595nm处。 生成BSA浓度与A595纳米的标准曲线，并用它来确定初始和上清液样品中蛋白质的浓度。 计算耦合蛋白的浓度如下： 计算偶联效率为： 00eq4.jpg“/> 在竞争性试验3.用珠子耦合粘附的制备： 种子每Hela细胞的孔1ml在浓度为150,000个细胞/毫升到24孔板的竞争性测定的前一天，以使细胞在实验开始前，达到约80％汇合。 设置每种实验条件下，一式三份。包括井阴性对照（无竞争过程中加入检测细菌），阳性对照和裂解控件（毒性实验）（耦合到融合标签只能在竞争测定加控制珠）。 接种5ml的海洋LB（MLB）文化与V的新的殖民地副溶血性弧菌和成长O / N在30℃下，抖。 准备足够的珠子耦合MAM，如第1（耦合）来描述​​。允许100毫升10倍珠子库存每孔。 比赛分析： 在competit的天离子实验，测量细菌培养物的OD 600。 由不含添加剂稀释细菌培养成无色的DMEM制备感染媒体，预先加热到37℃，含10％v / v的珠悬浮液（或者粘附偶联珠或对照珠），以得到10.以MOI制备1 ml的/孔和每个样品10-20％过量体积。注意：对于上面提到的条件（24孔板， 副溶血性弧菌 ，MOI 10），O / N培养物的必要量，以每孔（毫升/毫升）计算为3 / OD 600的培养物加入。例如，1毫升感染培养基中通常含有100个毫升珠粒悬浮液中，几毫升细菌培养物，并补足到1毫升无色，未补充的DMEM。 从井除去旧培养基，并通过添加1毫升无菌PBS预温至37℃至各孔洗涤培养的Hela细胞。 删除PBS和每孔加入1毫升传染媒介。同时设立对照，加入解续癌宁含有0.1％的Triton X-100（裂解控制，仅需要细胞毒性测量）控制珠子和细菌（阳性对照）或粘附素珠和无细菌（负对照），或DMEM。 孵育板在组织培养培养箱中于37℃所需的时间量（例如，4小时的细胞毒性测量或1小时为粘附测量）。 注意：两个细菌粘附和细胞毒性上的宿主细胞可以被用作读数抑制的效力。如果细胞毒性和粘附测量时间点重合，这两个测定法可以使用​​的样品来自相同井进行，因为细胞毒性，使用培养物上清和附着测定使用从剩余的细胞层来源的样品来确定。 细胞毒性测试： 在指定的时间点（例如，4小时后的感染），从每个24孔并转移到除去三次200毫升一个96孔板中。 旋转96孔板在1500×g离心5分钟，并转移100从每毫升早已进入一个新的96孔板中。加入100 ml期间感染实验的96孔板中一式三份的孔中新鲜使用的媒体的（这些将被用作空白）。 进行使用LDH细胞毒性检测试剂盒，并按照制造商的说明乳酸脱氢酶（LDH）释放测定。 简要地说，计算所需的25增量试剂的量（例如，如果62样品被测量，使足够的试剂混合物75等）。 例如，对于100个样本，混合11.25毫升试剂A的250微升试剂B.反转，不要旋涡，以避免起泡。 把该混合物在一个容器，以便能够移液用多通道移液器。加入100微升的试剂混合物的每个样品。 孵育板在RT和读取吸光度上酶标仪490nm处为10，20，30分钟。 </l我> 分析的量，裂解对照样品的吸收是高，但仍是板读数器（典型地，2-3个吸收单位）的线性范围内的数据集。 表述结果％的细胞毒性，使用下列公式进行转换： 测量细菌粘附的： 在指定的时间点（例如，1小时后感染），从细胞层中取出介质。 彻底无菌的，预温热的PBS（至少3-4次洗涤的1ml的PBS各）洗涤细胞层，以除去任何未附着的细胞。 裂解宿主细胞加入1ml无菌1％体积/体积的Triton X-100溶液的PBS每孔。孵育板在37℃下5分钟。 吸取各样品上下数次转印每个内容以及以分离1.5 ml的管之前。制备样品的10倍系列稀释成无菌PBS（例如，使用100个ml样品和900毫升的PBS）。 板100 ml的上MLB琼脂每一样品和散布使用细胞吊具。优化该稀释液根据细菌菌株和时间点到板。注意：对于所描述的实验设置，10 5或10 6倍稀释液得到的CFU的一个适当的数目。 孵育板在37°CO / N和菌落计数列举细菌。