の生理反応を測定します<em>ショウジョウバエ</em>ライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン

動物は生存と繁殖のための本質的な意思決定を媒介するために、嗅覚や味覚情報に依存しています。検出され、神経系によってどのように処理されるか化学感覚手がかり理解することは、感覚受容体（複数可）および対応する化学リガンドの同定を必要とする。 ショウジョウバエは、揮発性および非揮発性化合物の驚異的な多様性を検出し、生理を研究する中で優れたモデルですchemosensationのメカニズム。嗅覚器官が揮発性分子を認識しながら、味覚器官は低揮発性化合物を検出するために特化されます。ここでは、直接、低揮発性、親油性リガンドにキイロショウジョウバエの味覚器官からの神経細胞応答を測定するための方法を提示します。

ハエの味覚器官は前足、口吻、および翼を含みます。 sに応答する感覚器として知られている毛様構造は、味覚器官の表面に分布していますugars、ビター、塩、水およびフェロモン^8。感覚子は味の剛毛と味ペグ⁹に形態学的に分類されています。ロング（L型）に分類されている唇弁上の約31味覚毛、ショート（Sタイプ）と中間（i型）形態があります。糖に生理的に応答する'L'と's'の感覚器家4感覚ニューロン（S細胞）、低塩（L1細胞）、高塩と苦味化合物（L2細胞）と水（Wセル^{）10 、11。}高塩¹²に他の応答しながら'i'を、低塩と砂糖の両方に応答するそのうちの一つ感覚子家2感覚ニューロンを、。男性の約41味覚感覚器と前足の各々の上に分布し、女性で26感覚器があります。男性と女性の両方のために、脚の中央部に21感覚器、および後肢¹³で約22感覚器があります。足の味覚感覚器で囲まれた味覚ニューロンはまた、cはL1、L2、WとSタイプにlassified。

単一ニューロンからの電気的活動を測定するための1つの標準的な方法は、イオンの流れを記録するために、細胞外または細胞内の電極を使用します。電極の測定は、神経機能は、 ショウジョウバエの種、蛾、および神経標識のために大規模な遺伝子ツールを欠いているミツバチなどの非モデル生物で研究することを可能にします。しかし、電気生理学的方法は、日常的に、このアプローチを適用し、 ショウジョウバエの味覚感覚器^4,13,14の活性を測定するために使用されてきたが、いくつかの技術的な課題を提示します。まず、味の剛毛は形態および空間的な位置に基づいて特定する必要があります。識別されると、電気生理学的測定は、感覚器の小型化、による位置に制限のアクセシビリティ、および毛の味に化学的刺激の制御されたボリュームを適用することの難しさによって妨げことができます。また、感覚器を刺激は、複数の信号を生成することができますニューロンのタイプ^15。第二、電気信号​​の検出は、機械的振動や電子機器からのノイズに起因するバックグラウンドノイズによって混乱することができます。誤っ¹⁴を使用する場合第三に、先鋭化電極の使用は、フライの準備を損傷する可能性があります。最後に、電気生理学リグを組み立てると、刺激送達、信号記録、及びデータ分析のための特殊な電子部品を必要とし、高価であることができます。

D.でショウジョウバエ 、遺伝的にコードされたツールの利用可能性は、ニューロンの小集団の応答を検討することを可能にする画像化技術の開発が容易になりました。このようなアプローチの1つは、CaLexAレポーター¹⁶を使用することです。この方法では、のLexA-VP16転写因子及びカルシウム感受性タンパク質NFATをコードする遺伝子配列が一緒に融合されます。プロテインホスファターゼカルシニューリンのカルシウム活性化は、NFATの脱リン酸化を触媒し、順番に、facilita核へのインポートをTES。核内部に、LexAのドメインは、このように機能的に活性化されたニューロンの持続的な同定を可能にする、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターの発現を導くLexAop-DNA結合モチーフに特異的に結合します。アプローチは、付臭剤¹⁶へのライブハエの暴露後の触角葉における特定の嗅覚糸球体の応答を測定するために成功裏に使用されてきました。最近、IR52c味覚受容体ニューロンの生理学的反応はCaLexA ^7を使ってライブハエから測定しました。しかしながら、この研究のために、それは、GFPの転写を増強するために最大6週間齢のハエに必要でした。抗GFP抗体で免疫染色するCaLexA信号をブーストするために使用することができるが、この方法は、このように生細胞イメージングの可能性を排除し、組織の固定を必要とするであろう。

遺伝的にコードされたカルシウム指標タンパク質GCaMPも広範囲の数の神経細胞応答を研究するために使用されてきました種^17。タンパク質GCaMPは、神経刺激の前に、低強度で蛍光を発します。刺激の適用は、Ca ²⁺の流入で、その結果、神経細胞に活動電位をトリガします。 Ca ²⁺に結合したGCaMPは、それが明るい強度（ 図1）と蛍光を引き起こし、コンフォメーション変化を受けます。最近開発された単一ニューロンカルシウムイメージング法は、前足特定Gr61aの味覚ニューロン¹⁸のリガンドとしてグルコースを同定しました。本研究では、Gr61aの味覚ニューロンにおいてGCaMPを発現するトランスジェニックショウジョウバエから解剖前足は、撮像前にアガロースの層で覆われていました。しかしながら、解剖組織の使用は、測定時間と検出感度を制限し、GCaMP発現の最終的荒廃を引き起こすことができます。また、アガロースは、高い蛍光のバックグラウンドレベルとその光散乱特性に対する感度を制限することができます。

TOこれらの欠点のいくつかを解決、我々は前脚と口吻無傷の動物の味覚ニューロンからの生理的反応を記録するGCaMP媒介カルシウムイメージングの使用を記載しています。我々は（3 R、11 Z、19 Z）-3-アセトキシ-11,19-octacosadien -1-オール^{（CH503）20、} ショウジョウバエの脂質フェロモンに遺伝的にコードされGCaMP5G ^19を表現Gr68aとppk23ニューロンの生理学的応答を示します^21。ニューロンの応答は、フェロモン刺激時GCaMP5G信号の蛍光の増加を定量することによって測定されます。このプロトコルでは、ニューロンは、個々の細胞内の神経活動のパターンを区別するのに十分である120秒の総持続時間のために結像されます。