测量的生理反应<em>果蝇</em>感觉神经元脂质费洛蒙使用实时钙成像

动物依靠嗅觉和味觉的信息，以调解的生存和繁衍至关重要的决定。理解暗示如何化学感受检测和由神经系统处理要求感官受体（S）和相应的化学配位体的识别。 果蝇检测了惊人的各种挥发性和非挥发性化合物，并且在其中，研究生理极好模型机制的基本chemosensation。而嗅觉器官感知挥发性分子，味觉器官是专门用于检测低挥发性化合物。在这里，我们提出了直接测量果蝇的味觉器官低挥发性，亲脂性配体神经元的反应的方法。

苍蝇的味觉器官包括前腿，喙，和翅膀。分发的味觉器官的表面上是称为感器毛发状结构，其为s响应ugars，苦味，盐，水和费洛蒙^8。该感受器已形态分为刷毛的味道和口感钉^9。有关于被分类为长（l型）唇瓣约31味刷毛，短（S型）和中间体（i型）的形态。在'L'和'S'是生理糖回应感器房子4感觉神经元（在S细胞），低盐（L1细胞），高盐和苦味化合物（二级电池）和水（在W单元^{）10 ，11。}的“i”感器房屋2的感觉神经元，其中的一个响应既低盐和糖，而其他响应高盐^12。有男性约41的味道感受器和分布在每个前肢女26感器。对于男性和女性中，有21感器上midleg，并在后腿¹³约22感器。由味道感器上腿包围的味觉神经元还包含classified成L1，L2 W和S的类型。

从单个神经元测量电活动的一种标准方法使用外或细胞内的电极来记录离子流。电极测量允许非模式生物进行研究，例如果蝇 ，蛾，和缺乏神经标记广泛的遗传工具蜜蜂神经功能。然而，尽管电生理方法已被经常使用从果蝇味觉测量活动感器^4,13,14，运用这种方法存在一些技术挑战。首先，味道刷毛需要基于形态学和空间位置被识别。经鉴定，电测量可通过感受器的尺寸小的阻碍，限制无障碍由于位置，以及难以应用化学刺激的控制卷味道塞得满满的。另外，感器的刺激可以产生一个以上的信号神经型^15。其次，电信号检测可以通过从电子设备的机械振动和噪声产生的背景噪音混淆。三，使用锋利的电极会损坏飞行准备，如果使用不当^，14。最后，组装电钻机需要刺激递送，信号记录，和数据分析的专门的电子元件，并且可以是昂贵的。

在D.果蝇的基因编码工具的可用性提供了便利的成像技术，使神经元的小种群的反应进行研究开发。一种这样的方法是使用CaLexA记者^16。在此方法中，编码的LexA-VP16转录因子和钙敏感蛋白NFAT基因序列融合在一起。的蛋白磷酸酶钙调磷酸酶的钙活化催化NFAT的去磷酸化，并反过来，facilitaTES其导入到细胞核。在细胞核内时，LexA的结构域结合到其引导绿色荧光蛋白（GFP）报道分子的表达，从而使功能性激活的神经元的持续识别LexAop DNA结合基序。该方法已成功地用于测量以下的活苍蝇暴露于臭剂¹⁶具体嗅小球中的触角叶的响应。近日，IR52c味觉受体神经元的生理反应，从使用CaLexA ⁷活苍蝇测量。然而，对于本研究，这是必要的，以年龄苍蝇为长达6周，以提高GFP转录。同时用抗GFP抗体免疫染色可以用于促进CaLexA信号，这种方法将需要组织固定，从而排除了活细胞成像的可能性。

遗传编码的钙指示剂蛋白GCaMP也被广泛用于研究在一些神经元的反应种^17。蛋白质GCaMP前神经元的刺激荧光强度低。刺激的应用程序触发的神经元的动作电位，从而导致钙^离子的流入。 GCaMP，势必^钙 ，经历构象变化，导致它与亮强度（ 图1）发出荧光。最近开发的单神经元钙成像方法被用于鉴定葡萄糖作为配位体的前腿特定Gr61a味觉神经元^18。在这项研究中，从转基因果蝇中Gr61a味觉神经元表达GCaMP解剖前肢上覆盖成像之前琼脂糖层。然而，使用解剖组织可引起GCaMP表达的最终破旧，从而限制了测量时间和检测灵敏度。此外，琼脂糖可以限制灵敏度由于荧光的高背景水平及其光散射特性。

ŧO地址一些弊端，我们描述了使用GCaMP介导的钙成像的记录从前肢和长鼻完整的动物的味觉神经细胞的生理反应。我们表明Gr68a的表达遗传编码GCaMP5G ¹⁹至果蝇脂质信息素的生理反应和ppk23神经元，（3 的R，11 Z，19 Z）-3-乙酰氧基11,19-octacosadien -1-醇^{（CH503）20， 21。}神经元的反应是通过量化信息素的刺激过程中GCaMP5G信号的荧光增加测量。在这个协议中，神经元被成像为120秒，这足以区分在各个细胞神经元激活模式中的一个总的持续时间。