Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
Influenza A virüsü (IAV) giriş hedef hücrelere 1 plazma membranında reseptörlere virüs bağlayıcı ile başlayan bir çok-aşamalı süreçtir. IAV reseptörü glikoproteinlerin ve glikolipitlerin çok çeşitli üzerinde mevcut olan sialik asit. Viral zarf içinde mevcut olan IAV bir hemaglütinin (HA) proteini sialik aside bağlanır ve böylece hedef hücrelerin 2 plazma zarına viral partiküllerin bağlanmasına aracılık eder. Virüs 3-6 tarif edilmiştir klatrin dolayımlı endositoz yoluyla hücrelerin değil, aynı zamanda, makropinositozlar gibi alternatif giriş yolları, girer. HA ve sialik asit arasındaki etkileşim, her iki aracı bağlanma ve viral parçacıkların 7 içselleşmesini tetiklenmesi için yeterli olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, alternatif giriş reseptörleri öne sürülmüştür ve IAV girişi rolleri şu anda 1,8,9 araştırılmaktadır.
Sokak köpeğirently çabalar acil olarak ihtiyaç duyulan yeni antiviral tedaviler 10-12 geliştirilmesi amacıyla, virüsün yaşam döngüsünde yer alan ana bilgisayar faktörlerini tanımlamak için yapılır. Virüs girdi onun erken noktada viral enfeksiyon engellemek için IAV büyümeyi hedeflemek için olumlu bir adım olacaktır. Virüsün genellikle büyük miktarlarda gelen virüs tespit etmek gerekli olarak IAV girişi farklı aşamalarını Ölçme deneysel zordur. Buna ek olarak, virüs girişi değişiklikleri için algılama aralığı nedeniyle viral replikasyon eksikliği sadece doğrusal olduğunu. Bu yüksek hassasiyet ile tahliller ihtiyacını vurgulamaktadır.
Burada takdim deney hücreye birleşik virüs toplam miktarına bağlı olarak, hücre yüzeyinde bağlanmış virüsünün taranmasında olarak içsel virüs tespit edilmesine olanak sağlar. Biyotinlenmiş yabanıl tür virüsün kullanımı flow sitometri STV-Cy3'e ile boyama ve okuma yoluyla uygun ölçüm sağlar. Biyotinile virüs hücreye soğuk sınırdırs eki izin ancak viral parçacıkların içselleştirilmesi önlemek için. Hücreler, sabit permeabilize ve ekli virüs ölçmek için STV-Cy3 ile boyanmış olabilir. Bir bloke etme adımı olmayan hücreler etiketli streptavidin (STV) ile inkübe edildiği tespitten önce uygulanırsa, hücre dışı, bağlı virionlar sinyal iptal edilebilir. Bir sonraki adımda, biyotinlenmiş IAV bağlanmasını takiben, sıcaklık 37 ° C'ye kaydırılır ve viral parçacıkların içselleştirme gerçekleşmesi sağlanır. Içselleştirilmiş parçacıklar, böylece ekstra ve hücre içi virüsler arasında ayrımcılık sağlayan STV bağlanması korunur.
Deneysel koşul başına, dört numune gereklidir: '0 dk': İlk örnek, etiketlenmiş '0 dakika' hücre yüzeyinde soğuk bağlı virüs ölçmektir. '0 dk + STV': İkinci örnek, '0 dk + STV' etiketli, deney temel sinyal yoğunluğu verir. Ekli virüs zekâ engellendih STV ve STV-Cy3 ile sinyal aşağıdaki boyama '0 dak' örnek kıyasla çok daha düşük olmalıdır. '30 Dakika ': üçüncü numune, '30 dakika' nedeniyle, 30 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar bir sıcaklık geçişi eklenmiş ve virüs içselleştirilir içerir. '30 Dakika + STV ': Dördüncü örnek, '30 dakika + STV' önlemler virüslerin hücre içi fraksiyon. STV bloke etme adımı 30 dakika inkübasyon süresi sonrasında uygulanır. Bunun bir sonucu olarak, hücre yüzeyinde viral partiküller STV- Cy3 ile lekeleme için tek içsel virüsleri uygun ayrılan STV bağlıdırlar. Içsel virüs nispi miktarı '(örnek '30 dakika tarafından anlatıldığı gibi) bir virüs toplam miktarına bölünmesiyle elde edilen (örnek '30 dakika + stv olarak ölçülür)' içsel virüs oranı olarak hesaplanabilir.
Kontroller olarak, sözde-enfekte edilmiş hücreler dahil etmektedir. Mock-enfekte olmuş hücrelerde STV-Cy3 boyaması aşağıdaki sinyal arka plan verirboyama protokolünden elde edilir. IAV bağlanması için bir kontrol bakteriyel nöraminidaz (NA) içeren hücrelerin önceden bir tedavi yöntemidir. Hücresel glikoproteinlerin gelen sialik asit kapalı NA böler, böylece hücre yüzeyinden eki reseptörleri çıkarılması. Sodyum azid (SA) etkili bir metabolizma inhibitörüdür ve böylece blok 13, endositoz. Sodyum azid ile muamele hücreler internalizasyonundan bağlanma virüsü için pozitif ancak negatif olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim protokol akış sitometri virüs eki ve içselleştirilmesi ölçmek için kolay bir yol açıklar. Bu, virüs benzeri partiküller (VLP'ler) kullanımı ile karşılaştırıldığında bu daha yakından taklit virüsü enfeksiyonlarının etiketli yabanıl tür virüsün kullanılmasını mümkün kılar. Protokol IAV bağlanmasını ve içselleşmesini ölçmek için optimize edilmiş olsa da kolayca diğer virüsler için adapte edilebilir. Akış sitometri okuma için kullanılan ek olarak, ko-renklendirm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma SST İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_135278) bir hibe ile desteklenmiştir. MOP AXA Araştırma Fonu doktora hibe faydalanıcısı olduğu. Biz Şekil 1 tasarımı ile yardım için Patricia Nigg teşekkür ederiz.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
