Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca²⁺ In Aged hippocampus Neuronen

Excitotoxiciteit is een van de belangrijkste mechanismen die bijdragen aan neuronale schade en celdood in neurologische beledigingen zoals ischemie, en in sommige neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer ^1. Dit type neurotoxiciteit wordt voornamelijk gemedieerd door glutamaat handelen over Ca ²⁺ -doorlaatbare, ionotrope NMDA-receptoren (NMDAR) ^2. Blootstelling van gekweekte neuronen glutamaat excitotoxiciteit kan tot ^3, waarbij neuronale apoptose ⁴ veroorzaakt. Wij en anderen hebben eerder gemeld dat neuronale gevoeligheid voor NMDA-geïnduceerde apoptose kan veranderen in vitro ontwikkeling en veroudering ^5-8.

Het is algemeen aanvaard dat een toename van de vrije cytosolische ^Ca2 + -concentratie ^([Ca2 +] _cyt) leidt tot activatie cellen. Als dit echter aanleiding te hoog is en / of voldoende duurzame, kan celdood ⁹ leiden. Bovendien is voorgestelddat excitotoxiciteit vereist mitochondriale ^Ca2 + opname ^10, aangezien het behandelen neuronen met een mitochondriale ontkoppelaar beschermd neuronen tegen door glutamaat geïnduceerde celdood ^11. Indien mitochondriën te veel ^Ca2 +, kan de opening van de mitochondriale permeabiliteittransitieporie plaatsvinden, waardoor los van cytochroom C en andere pro-apoptotische factoren, en het induceren van apoptose. We hebben onlangs aangetoond dat mitochondriële ^Ca2 + opname direct gerelateerd aan de leeftijd afhankelijke gevoeligheid voor excitotoxiciteit, door direct meten van NMDA-geïnduceerde mitochondriale ^Ca2 + opname in enkele hippocampale neuronen ^5, een werkwijze die is beschreven in dit artikel. De hippocampus, die betrokken zijn bij fysiologische processen zoals leren, geheugen en andere cognitieve processen ^12, zeer gevoelig voor veroudering en neurodegeneratieve aandoeningen ^13. Voorgesteld is dat, na een aantal weken in vitro gekweekthippocampale neuronen tonen een aantal typische kenmerken van oude neuronen ^14. Dienovereenkomstig kan op lange termijn gekweekte hippocampale neuronen een alomvattend model Ca ²⁺ gemedieerde mechanismen van verbeterde excitotoxiciteit bij veroudering onderzoeken bieden.

Het algemene doel van de gepresenteerde methode is dan ook aanzienlijke veranderingen in intracellulaire ^Ca2 + homeostase of ^Ca2 + remodellering in de ouder wordende hersenen onderzoeken waaronder differentiële ^Ca2 + responsen opgewekt door NMDA receptor agonisten op lange-termijn gekweekte hippocampale neuronen . De werkwijze bevat een gedetailleerde beschrijving van de cultuur van rat hippocampale neuronen en de controle cytosolische en mitochondriale ^Ca2 + concentraties van fluorescentie en bioluminescentie beeldvorming in individuele neuronen, respectievelijk. Fluorescentiebeelvorming van cytosolisch ^Ca2 + in gekweekte neuronen is een standaardprocedure. Deze methode is minder betrouwbaar voor subcellulaire ^Ca2 + metingen zoals mitochondriale ^Ca2 +. Redenen hiervoor zijn onder andere het ontbreken van een goede afstemming van de synthetische probes en ongepast affiniteit voor Ca ²⁺ concentraties die kunnen veranderen in de mitochondriën van de lage uM niveau zelfs tot het mM niveau. Het gebruik van ^Ca2 + probes op basis van eiwitten zoals bijvoorbeeld aequorine, kon de targeting naar subcellulaire organellen en gebruik van derivaten verschillende ^Ca2 + affiniteiten met verschillende coelenterazines of gemuteerde probes ontbreekt specifieke ^Ca2 + bindingsplaatsen ^15. Op deze wijze kan bioluminescentie beeldvorming van cellen die aequorine-mitochondriën gerichte monitoring van mitochondriale ^Ca2 + concentraties in individuele neuronen mogelijk te maken. Toch kan deze procedure het gebruik van fotontellende camera's of ultragevoelige CCD camera's voor bioluminescentie ^16-18 vereist. Deze werkwijze kan nieuwe resultaten op die in meer establ worden bevestigdished hersenen veroudering modellen als, bijvoorbeeld, de hersenen plakjes van oude dieren.