Идентификация Metal Oxide наночастиц в гистологических образцов Enhanced Темнопольный микроскопии и Гиперспектрального карт
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
В наноматериалы все шире используются в различных отраслях промышленности, существует потребность в наноразмерных изображений и характеристика методов, которые более быстрым, доступным и удобным, чем традиционные методов, таких как электронная микроскопия. Для визуализации наночастиц (NP) взаимодействия с клетками, тканями и живых систем, многие оптические методы были использованы, в том числе дифференциальной помехи контраста (DIC) микроскопии 1 и неоднородные поля на основе таких подходов, как полного внутреннего отражения (TIR) или ближней сканирования оптической микроскопии (NSOM) 2,3. Тем не менее, эти высококачественные аналитические подходы, в недоступном для большинства неспециалистов лабораториях 4. Электронная микроскопия, в том числе электронной микроскопии (ПЭМ), также был использован для изучения NP взаимодействие с клетками 5,6,7,8. Высокий угол кольцевой темного поля (HAADF) сканирование электронной микроскопии был использован для изучения взаимодействия наночастицвирусами 9. Конфокальной микроскопии является еще одним популярным методом, используемым для изучения NP-клеточные взаимодействия 10.
В последние годы, гиперспектрального томография (HSI) методы темнопольные основе были использованы в качестве перспективного аналитического инструмента для изучения NPS в биологических матриц 11. Системы HSI генерировать трехмерное представление пространственных и спектральным данным, известным как гиперкуба или Datacube 12. Пространственная карта спектрального хода используется для идентификации материала. Спектральные профили известных материалов могут быть получены и использованы в качестве справочных библиотек для сравнения неизвестных образцов. Одним из главных преимуществ системы с HSI является его способность сочетать с изображений спектроскопии, таким образом устанавливая расположение и распределение неизвестных наночастиц в живом организме или исключая виво, а также связывая их на другое исходное частицы, известной, аналогичного состава.
Есть несколько преимуществс помощью системы HSI по сравнению с обычными методами обработки изображений: минимальный подготовки образца не требуется; пробоподготовка, как правило, неразрушающий характер; приобретение и анализа изображений быстрее; техника является экономически эффективным 13; и пространственное распределение и анализ соединений смешанного состава и / или в комплексных матриц становится более легким, 14.
Для наноматериалов исследований с участием драгоценные образцы, один из самых важных вопросов является наличие неразрушающим методом визуализации, который позволяет потенциал многократно исследовать образцы от одного или более методов. Неоднократный или несколько анализов может быть желательно разработать комплексные наборы данных, которые не будут доступны из одного метода. Для этой связи, изучение ее оптические свойства является самым безопасным способом анализа образца. При использовании усиливается темнопольном микроскопе (EDFM) и систему HSI изучать оптический отклик образца, а именно – Reflectance, но также абсорбцию и пропускания – идентификация функция и характеристика может быть выполнена 15. Потенциальные конечные характеристика включает оценку относительного размера и формы наночастиц или агломератов и распределение наночастиц в образце.
В этой статье мы опишем методы отображения специально для оксидов металлов наночастиц в посмертном ткани с использованием системы HSI на основе пикселей спектральных алгоритма матч называют спектральной угол преобразователя (SAM). Мы выбрали именно эту заявку, потому что у него есть потенциал, чтобы дополнить текущий и будущее в естественных условиях исследования нанотоксикологии, в котором животные модели, используемой для оценки последствий для здоровья воздействия наноматериалов на. Применение этого метода может также сообщить наноразмерных исследований доставки лекарств, который использует ткани или животного модели. В частности, наночастиц поглощения, распределения, метаболизма и выведения, по всей Organs и ткани могут быть исследованы с помощью этой системы. Широкое разнообразие приложений изучаются для использования в медико-биологических исследований 11.
Этот метод может быть использован для оценки различных биологических образцах (например, типов различных тканей, бронхоальвеолярного лаважа образцы и мазках крови), которые были подвержены наночастиц различных элементным составом 16-19. Кроме того, этот метод полезен для изучения наночастиц биораспределение в виво и ин витро, который уместен для исследований доставки наноразмерных препарат 11. Кроме биологических образцов, EDFM и HSI может быть использован для оценки наночастиц в пробах окружающей среды, таких как сточные воды 20. Профессиональные оценки воздействия можно облегчить путем использования этой техники, а также, так как он может быть использован для оценки эффективности средств индивидуальной защиты для предотвращения проникновения наночастиц. Кроме того, исследования теутра в настоящее время разрабатывает аналогичную EDFM и протокол HSI для оценки образцов фильтрующий материал наночастиц, собранных из оценок профессиональных воздействия. В то время как подготовка этих различных типов образцов для EDFM и HSI может варьироваться, важно, что они получают таким образом, что они могут быть легко визуализированы с помощью оптической системы. Как правило, образец должен быть получен, как если бы он быть визуализированы с помощью традиционного светлого микроскопии. Есть несколько систем гиперспектрального изображений коммерчески доступные 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для образцов тканей, которые подверглись обычный гистологический окрашивание, выявление и анализ наночастиц оксидов металлов может быть достигнуто путем сочетания EDFM, отображение HSI, и методов анализа изображений. В то время как есть гибкость в подготовке проб для гистологии или иммуногистохимии (например, с использованием фиксированных или замороженные ткани; тип пятно), важно, что образцы подразделяются на толщину 5-10 мкм для оптимальной визуализации. Образцы, используемые здесь, были фиксированные формалином и парафин до секционирования с помощью роторного микротома до 6 мкм толщины, установленный на предметные стекла микроскопа, окрашивали гематоксилином и эозином и coverslipped. Свиные тканей кожи от экс естественных кожного сотрудничестве проникновения токсикологии были использованы в данном исследовании. Ткани были подвергнуты наночастиц оксида металла (алюминия, диоксид кремния, оксида церия) в водных суспензиях. Обнаружение области (ы) интересов (высокая контрастность ElemeНТС) с EDFM является важным первым шагом, что облегчает последующее отображение и анализ HSI. Положительные и отрицательные контрольные образцы должны быть отображены и проанализированы сначала, чтобы создать библиотеку спектрального для справки. Собранные спектры от положительного контроля экспортируются в положительный контроль спектральной библиотеке. Затем, все спектры от негативных образов контроля вычитают из спектральной библиотеки положительного контроля для того, чтобы улучшить специфичность (снижение ложных срабатываний). В результате фильтрации спектральная библиотека считается RSL, который служит для анализа материалов, представляющих интерес. Все образцы ткани проходят такую же обработку изображения и отображаются против RSL. Полученное изображение будет содержать только участки с элементами интерес на черном фоне. Это изображение может затем быть проанализированы с помощью ImageJ его порог и анализ частиц функции, чтобы получить площадь отображенных частиц в поле зрения. Числовые данные, полученные от ImageJ может быть экспортред в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
Важно учесть, что, как биологические образцы по своей природе отличаются друг от друга, и методы окраски может повлиять визуализации через EDFM и HSI, установки экспозиции должна быть определена в соответствии с тем, что обеспечивает наилучшее высокой контрастности изображения для конкретного типа образца. Хотя снижение ложных срабатываний может быть достигнуто путем фильтрации спектральных библиотек, важно, чтобы получить достоверные отрицательные элементы управления, которые бы избежать загрязнения с элементом интерес, так как спектры, соответствующие этой загрязнения потенциально может быть отфильтрован от спектральной библиотеки положительного контроля в , увеличивая ложные отрицательные темпы. Кроме того, диапазон спектра интенсивности, что можно обнаружить с гиперспектральной обработки изображений не может превзойти предел конкретного программного обеспечения (для данного исследования, то есть 16000 единиц): районы с большим количеством накопленных частиц, которые производят зрectral интенсивности выше предела интенсивности исключены из спектрального библиотеки, из-за риска увеличения числа ложных отрицательных.
В то время как система HSI дает много преимуществ по сравнению с традиционными методами, есть некоторые недостатки и ограничения, которые следует учитывать. Во-первых, большим количеством оптических данных, собранных может потребовать значительных вычислительных мощностей. Другой является то, что HSI может быть время интенсивного, особенно на начальных этапах, когда создаются ссылки спектральные библиотеки. Кроме того, время визуализации может потребоваться несколько минут в захвате изображения, что делает его медленнее, чем простой визуализации темнопольным; Однако, это еще быстрее, чем выполнение подготовки выборки и визуализации с помощью электронной микроскопии. Кроме того, сложные системы могут привести к нескольким характерным спектрам, которые требуют развития узкоспециализированных управления и сделать создание стандартизированных универсальных справочных библиотек сложных 26. Наконец, технологияNique приводит низким разрешением, чем через зонд или электронной микроскопии методами, такими как атомно-силовой микроскопии или электронной микроскопии, которые могут разрешить отдельные атомы. Разрешение этой техники является ограниченным из-за его фотонной природы, которая предотвращает его от высокоточный инструмент для измерения размеров частиц в нанометровом уровне или для точной локализации материалов на уровне субмикронных. В то время как этот метод может быть в состоянии определить частицы в определенных средах ткани или клеточных органелл больше 1 мкм (например, клеточные ядра), меньшие органеллы или функции являются сложными для визуализации точно с помощью этого метода. Также следует отметить, учитывая его пространственное разрешение, этот метод не может различать отдельных наночастиц и агломератов 11.
Другие соображения включают в себя: некоторые материалы (например, благородных металлов) имеют гораздо более высокий коэффициент отражения и различные спектральные профили, которые могут сделать их легче анаZE и спектрально карту с помощью этого инструмента. Другие, такие как оксиды полуметаллических исследованных в этом исследовании и углеродных наноматериалов 24, 27, может быть более сложной, из-за их элементного состава, формы, и в зависимости от матрицы. В двух мышиных ингаляционных исследований по Mercer и др., Подобная система с одной используемой в данном исследовании была использована для того, чтобы найти углеродных нанотрубок в легких и в средних органов в зависимости от их чрезвычайно высокой контрастностью с окружающими тканями. Тем не менее, гиперспектрального отображение не была продемонстрирована в обоих исследованиях, вероятно, потому, что уникальная форма углеродных волокон была достаточно черта для идентификации. Еще одно соображение относится конкретно к тканям: с нанесения наночастиц интерес к определенным органам по обычным биофизических процессов непредсказуемо (и часто сам предмет исследования), определение применимого положительного контроля может быть трудным и требует рассмотрения того, как поколение управления мIGHT влияет на состояние интересующего материала. Например, если спектральная библиотека создана из нетронутых наночастиц интерес, может быть трудно отобразить библиотеку на тех же наночастиц в ткани или клетки за счет изменений в спектре в результате изменения частицы (например, в связи с изменением рН, растворение, агломерация, связывание белка) и в целом микросреда или матрица. Наконец, метод ограничен в своей полуколичественного характера: он может быть только в количественной других методов двумерной микроскопии аналогичное решение, что означает, что не может быть легко использована для выполнения задач, таких как, характеризующий общее органа нагрузку материала.
В целом, EDFM и HSI обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с обычными наноматериал изображений и характеристика методов, таких как ТЕМ, HAADF и DIC. EDFM / HSI позволяет быстрее получения изображения и анализа, что позволяет экономить время и затраты по сравнению с более интенсивной Конвенные методы. Кроме того, подготовка проб для EDFM / HSI, как правило, как минимальная и неразрушающего, что экономит время, а также позволяет более гибко анализа данного образца, так как это может быть использовано для других методов. Кроме того, HSI является универсальным, что позволяет анализа наноматериалов многих композиций и в различных матриц. Исследовательская группа работает для уточнения способа, описанного здесь для других материалов и типов образцов, в том числе в углубленной оценки специфики технологии. Критический следующий шаг под следствием исследовательской команды проверка этих методов против традиционных золотых стандартов (например, комбинационного рассеяния, ПЭМ, РЭМ) для материалов и типов тканей, представляющих интерес.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
References
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. . Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. . Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. . Special stains and H&E. , (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
