Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Como nanomateriais são cada vez mais usados em uma variedade de indústrias e aplicações, existe uma necessidade de métodos de imagem em nanoescala e caracterização que são mais rápido, acessível e conveniente do que as modalidades tradicionais, como a microscopia eletrônica. Para visualizar as interações de nanopartículas (NP) com as células, tecidos e sistemas vivos, têm sido empregadas muitas técnicas ópticas, incluindo contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia 1 e abordagens baseadas em campo evanescente, como a Total Internal Reflection (TIR) ou quase microscopia de varrimento de campo óptico (NSOM) 2,3. No entanto, estas são abordagens analíticas de ponta, fora do alcance da maioria dos laboratórios não especializados 4. A microscopia electrónica, incluindo microscopia electrónica de transmissão (TEM), também tem sido utilizada para estudar a interacção com células 5,6,7,8 NP. Alto ângulo anular darkfield (HAADF) digitalização microscopia eletrônica de transmissão tem sido usado para estudar a interação de NPscom vírus 9. A microscopia confocal é uma outra técnica popular usada para estudar as interações célula-NP 10.
Nos últimos anos, imagem hiperespectral (HSI) técnicas baseadas em campo escuro foram utilizados como uma ferramenta analítica promissora para estudar NPs de 11 em matrizes biológicas. Sistemas HSI gerar uma representação tridimensional de dados espaciais e espectrais, conhecido como um hipercubo ou datacube 12. O mapa espacial de variação espectral é usado para identificação do material. Perfis espectrais de materiais conhecidos pode ser gerado e utilizado como bibliotecas de referência para comparação com as amostras desconhecidas. Uma das vantagens principais com sistemas HSI é a sua capacidade de combinar imagiologia com espectroscopia, estabelecendo assim a localização e distribuição de NPs desconhecidos in vivo ou ex vivo, bem como ligando-os a uma outra partícula de referência conhecida, a composição semelhante.
Há várias vantagens deutilização de sistemas de HSI sobre técnicas de imagem convencionais: a preparação da amostra mínima é necessária; preparação da amostra é tipicamente não-destrutiva na natureza; aquisição e análise de imagem é mais rápida; a técnica é de 13 rentável; ea distribuição espacial e análise de compostos de composição mista e / ou em matrizes complexas é mais facilmente conseguido 14.
Para nanomateriais pesquisa envolvendo amostras preciosos, uma das considerações mais importantes é a disponibilidade de um método de imagem não destrutivo, que permite o potencial para examinar amostras repetidamente por um ou mais métodos. Repetida ou múltiplas análises pode ser desejado o desenvolvimento de conjuntos de dados globais, que não estariam disponíveis a partir de um único método. Para este respeito, estudando suas propriedades ópticas é a forma mais segura para analisar a amostra. Usando um microscópio de campo escuro reforçada (EDFM) e HSI sistema para estudar a resposta óptica da amostra – nomeadamente Reflectance, mas também absorvância e transmitância – identificação e caracterização recurso pode ser realizada 15. Endpoints potenciais caracterização incluirá uma avaliação do tamanho e forma de nanopartículas ou aglomerados e distribuição das nanopartículas dentro de uma amostra relativa.
Neste artigo, descreve métodos de mapeamento especificamente para as nanopartículas de óxido de metal no tecido post-mortem usando um sistema HSI baseado em um algoritmo jogo pixel-espectral referido como um mapeador ângulo espectral (SAM). Nós escolhemos esta aplicação em particular porque ele tem o potencial para complementar atual e futura no domínio da investigação nanotoxicology vivo, em modelos animais são usados para avaliar as implicações para a saúde da exposição a nanomateriais artificiais. A aplicação deste método pode também informar a investigação entrega da droga em nanoescala que utiliza modelos de tecido ou animais. Em particular, a absorção de nanopartículas, distribuição, metabolismo e excreção em todo organs e tecidos poderiam ser investigados com este sistema. Uma grande variedade de aplicações estão sendo investigados para uso em investigação biomédica 11.
Este método poderia ser utilizado para a avaliação de amostras biológicas diferentes (tais como vários tecidos, tipos de amostras de lavagem bronco-alveolar, e esfregaços de sangue) que tenham sido expostos a nanopartículas de uma variedade de composições elementares 16-19. Além disso, este método é útil para o estudo de nanopartículas biodistribuição in vivo e in vitro, que é pertinente para os estudos de libertação de fármacos 11 nanoescala. Além amostras biológicas, EDFM e HSI pode ser utilizado para avaliar as nanopartículas em amostras ambientais, tais como esgotos 20. Avaliação da exposição ocupacional pode ser facilitada pela utilização desta técnica, bem como, uma vez que pode ser utilizado para avaliar a eficácia do equipamento de protecção individual na prevenção da penetração de nanopartículas. Além disso, a pesquisa de team está actualmente a desenvolver um EDFM semelhante e protocolo HSI para a avaliação de amostras de mídia de filtro de nanopartículas coletados a partir de avaliações de exposição ocupacional. Embora a preparação destes diferentes tipos de amostras para EDFM e HSI pode variar, é importante que eles são preparadas de tal forma que eles podem ser facilmente visualizados pelo sistema óptico. Tipicamente, a amostra deve ser preparado como se iria ser visualizado através de microscopia de campo claro tradicional. Existem vários sistemas de imagem hyperspectral comercialmente disponíveis 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para amostras de tecido que foram submetidos a coloração histológica convencional, a identificação e análise de nanopartículas de óxido de metal pode ser conseguida através de uma combinação de EDFM, mapeamento HSI, e técnicas de análise de imagem. Embora haja flexibilidade na preparação de amostras para histologia ou imuno-histoquímica (por exemplo, usando tecidos fixados ou congelados; tipo de mancha), é importante que as amostras são seccionados a uma espessura de 5-10 mm para melhor visualização. As amostras usadas aqui foram fixados em formalina e antes de seccionamento com um micrótomo rotativo a 6 mm de espessura embebido em parafina, montadas em lâminas de vidro para microscópio, coradas com hematoxilina e eosina e lamínulas. Tecidos da pele de suíno de um ex vivo colaboração penetração cutânea toxicologia foram usadas para este estudo. Os tecidos foram expostos a nanopartículas de óxido de metal (alumina, sílica, céria) em suspensões aquosas. Detecção da região (s) de interesse (eleme alto contrastents) com EDFM é um primeiro passo crítico que facilita a posterior mapeamento e análise HSI. Amostras de controlo positivas e negativas devem ser visualizados e analisados em primeiro lugar, a fim de criar uma biblioteca espectral para referência. Os espectros coletados a partir do controlo positivo são exportados para uma biblioteca espectral controlo positivo. Em seguida, todos os espectros a partir das imagens de controlo negativo são subtraídos da biblioteca espectral do controlo positivo, a fim de melhorar a especificidade (reduzir os falsos positivos). A biblioteca espectral filtrado resultante é considerado o RSL que serve para a análise dos materiais de interesse. Todas as amostras de tecido são submetidos ao mesmo processo de imagem e são mapeados contra o LSR. A imagem resultante irá conter apenas áreas com elementos de interesse sobre um fundo preto. Esta imagem pode então ser analisado utilizando o ImageJ com as suas funções de limiar e de análise de partículas para se obter a área de partículas mapeados por campo de visão. Os dados numéricos obtidos a partir ImageJ pode ser exportaçãoed para uma planilha para análise posterior.
É importante considerar que, como amostras biológicas são inerentemente diferentes um do outro, e métodos de coloração pode afetar a visualização através EDFM e HSI, as configurações de exposição deve ser determinado de acordo com o que produz a melhor imagem de alto contraste para um tipo específico de amostra. Embora a redução de falsos positivos pode ser conseguido através da filtragem de bibliotecas espectrais, é crucial para se obter controlos negativos fiáveis que têm evitado a contaminação com o elemento de interesse, como o espectro correspondente a esta contaminação poderia potencialmente ser filtrados a partir da biblioteca espectral do controlo positivo , aumentando as taxas de falsos negativos. Além disso, a faixa de intensidade espectro que é detectável com o software de imagem hyperspectral não pode ultrapassar o limite do software particular (para este estudo, ou seja, 16.000 unidades): áreas com um elevado número de partículas acumuladas que produzem spintensidades ectral acima do limite de intensidade são deixados de fora da biblioteca espectral, devido ao risco de aumentar o número de falsos negativos.
Enquanto o sistema HSI confere muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais, existem algumas desvantagens e limitações a considerar. Uma delas é que a grande quantidade de dados ópticos recebidos podem exigir poder de computação substancial. Outra é que HSI pode ser demorada, principalmente nos estágios iniciais, quando as bibliotecas de espectros de referência estão sendo criados. Além disso, o tempo de imagem pode levar vários minutos por captura de imagem, tornando-o mais lento do que simples imagem de campo escuro; No entanto, é ainda mais rápido do que a execução preparação das amostras e visualização por microscopia electrónica. Além disso, sistemas complexos pode resultar em vários espectros característicos, que exigem o desenvolvimento de controles altamente especializados e fazer o estabelecimento de, bibliotecas de referência universais padronizados difíceis 26. Finalmente, a tecnologianique resultados em resolução mais baixa do que as técnicas probe- ou elétron-microscopia, tais como microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de transmissão, que podem resolver átomos individuais. A resolução dessa técnica é limitada devido à sua natureza fotônico, que a impede de ser uma ferramenta de alta precisão para medir tamanhos de partículas no nível nanométrico ou para localizar precisamente materiais a um nível sub-micron. Enquanto que a técnica pode ser capaz de identificar partículas dentro de determinados compartimentos de tecidos ou organelas celulares superiores a 1 uM (tais como núcleos de células), ou organelos pequenos recursos são difíceis de visualizar com precisão com este método. Também digno de nota, dada a sua resolução espacial, este método não pode diferenciar entre as nanopartículas individuais e aglomerados 11.
Outras considerações incluem: certos materiais (como metais nobres) têm muito mais elevada reflectância e perfis espectrais distintas, o que pode torná-los mais fáceis de Analyze e mapa espectral com esta ferramenta. Outros, tais como os óxidos metálicos semi-investigados neste estudo e nanomateriais à base de carbono 24, 27, pode ser mais difícil, devido à sua composição elementar, forma, e de acordo com a matriz. Em dois estudos de inalação de murino por Mercer et ai., Um sistema similar ao empregue no presente estudo foi utilizada a fim de localizar os nanotubos de carbono no pulmão e nos órgãos secundários com base na sua extraordinariamente elevado contraste com os tecidos circundantes. No entanto, o mapeamento hiperespectral não foi demonstrada em qualquer um dos estudos, provavelmente porque a forma única de fibras de carbono foi suficiente para uma característica de identificação. Outra consideração refere-se especificamente aos tecidos: desde depositando nanopartículas de interesse para órgãos específicos através de processos biofísicos normais é imprevisível (e muitas vezes ele próprio objecto de estudo), determinação de um controlo positivo aplicável pode ser difícil e requer a consideração de como a geração do controle mIGHT afetar o estado de um material de interesse. Por exemplo, se uma biblioteca espectral é criado a partir de nanopartículas cristalinas de interesse, pode ser difícil para mapear a biblioteca para as mesmas nanopartículas em tecidos ou células, devido a alterações nos espectros resultantes da alteração da partícula (por exemplo, devido a alterações nas pH, dissolução, aglomeração, a ligação às proteínas) e do microambiente global ou matriz. Finalmente, a técnica está limitada na sua natureza semi-quantitativa: ela só pode ser tão quantitativa como outras técnicas de microscopia bidimensional de resolução semelhante, o que significa que não pode ser facilmente usado para executar tarefas, tais como caracterização de carga órgão total de um material.
No geral, EDFM e HSI fornecer várias vantagens em relação às técnicas convencionais de imagem e caracterização de nanomateriais, como TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permite a aquisição de imagens mais rápido e análise, o que economiza tempo e custo em comparação com mais conven intensivatécnicas adicionais. Além disso, a preparação da amostra para EDFM / HSI é tipicamente tanto mínima e não destrutiva, o que poupa tempo e também permite uma análise mais flexível de uma dada amostra, uma vez que pode, em seguida, ser utilizados para outras técnicas. Além disso, a HSI é versátil, permitindo a análise de materiais em nano-escala e de muitas composições numa grande variedade de matrizes. A equipe de pesquisa está trabalhando para aperfeiçoar o método descrito aqui para outros materiais e tipos de amostras, incluindo uma avaliação aprofundada da especificidade da tecnologia. A próxima etapa crítica sob investigação pela equipa de investigação é a validação dessas técnicas em relação aos padrões tradicionais de ouro (por exemplo, Raman, TEM, SEM) para os materiais e tipos de tecido de interesse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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