Identifizierung von Metalloxid-Nanopartikeln in histologischen Proben durch verbesserte Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrale Kartierung
Summary
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
Als Nanomaterialien werden zunehmend in einer Vielzahl von Branchen und Anwendungen verwendet wird, gibt es einen Bedarf für nanoskalige Bildgebung und Charakterisierungsmethoden, die eine schnellere, erschwinglich und bequemer als traditionelle Modalitäten wie Elektronenmikroskopie sind. Nanopartikel (NP) Wechselwirkungen mit Zellen, Geweben und lebenden Systemen viele optische Techniken eingesetzt worden, einschließlich der Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie 1 und abklingende Feld basierte Ansätze, wie beispielsweise innere Totalreflexion (TIR) oder Nah- visualisieren Rasterlichtmikroskopie (NSOM) 2,3. Allerdings sind diese High-End-Analyseansätze, außerhalb der Reichweite der meisten Nicht-Fachlaboren 4. Elektronenmikroskopie, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), ist ebenfalls verwendet worden, um NP Wechselwirkung mit Zellen 5,6,7,8 studieren. Hohe Winkelringdunkelfeld (HAADF) Rastertransmissionselektronenmikroskop wurde genutzt, um die Wechselwirkung von Nanopartikeln untersuchenmit Viren 9. Konfokale Mikroskopie ist eine weitere beliebte Technik zur NP-Zell-Interaktionen 10 zu studieren.
In den letzten Jahren haben Dunkelfeld-basierten hyperspektrale Bild (HSI) -Techniken als vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung der analytischen NPs in biologischen Matrizen 11 verwendet. HSI Systeme erzeugen eine dreidimensionale Darstellung der räumlichen und spektralen Daten, als Hypercube oder DATACUBE 12 bekannt. Die räumliche Karte von spektralen Variation für Materialidentifikation verwendet. Spektralprofile bekannte Materialien erzeugt und als Referenzbibliotheken für den Vergleich mit unbekannten Proben verwendet werden. Einer der großen Vorteile, die mit HSI Systemen ist ihre Fähigkeit, mit Abbildungsspektroskopie kombiniert realisiert und damit die Lage und Verteilung der unbekannten NPs in vivo oder ex vivo sowie deren Verknüpfung mit einem anderen Referenzpartikel von bekannten, ähnlichen Zusammensetzung.
Es gibt mehrere Vorteile dermit HSI-Systeme gegenüber konventionellen bildgebenden Verfahren: minimale Probenvorbereitung erforderlich ist; Probenvorbereitung ist in der Regel nicht-destruktive in der Natur; Bildaufnahme und Analyse schneller ist; die Technik kostengünstig ist 13; und die räumliche Verteilung und die Analyse von Verbindungen mit gemischter Zusammensetzung und / oder in komplexen Matrizen leichter durchgeführt 14.
Für Nanomaterialien Forschung mit wertvollen Proben, ist einer der wichtigsten Aspekte der Verfügbarkeit einer zerstörungsfreien bildgebendes Verfahren, das für das Potential wiederholt untersuchen Proben durch eine oder mehrere Methoden ermöglicht. Wiederholte oder mehrere Analysen erwünscht, um umfassende Datenbestände, die nicht wäre von einer einzigen Methode zur Verfügung zu entwickeln. Um dieser Hinsicht studiert seine optischen Eigenschaften ist der sicherste Weg, um die Probe zu analysieren. Durch Verwendung eines verstärkten Dunkelfeldmikroskop (EDFM) und HSI-System, um die optische Antwort der Probe zu untersuchen – nämlich reflectance, aber auch die Absorption und Durchlässigkeit – Funktion Identifizierung und Charakterisierung durchgeführt 15 werden. Potenzielle Charakterisierung Endpunkte umfassen eine Beurteilung der relativen Größe und Form von Nanopartikeln oder Agglomerate und Verteilung von Nanopartikeln in einer Probe.
In diesem Papier beschreiben wir Mapping-Methoden, die speziell für Metalloxid-Nanopartikeln in post-mortem Gewebe mit einem HSI-System basiert auf einer Pixel-spektrale Übereinstimmung Algorithmus, um als spektraler Winkel Mapper (SAM) bezeichnet. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung, weil sie das Potenzial, um in vivo Nanotoxikologie Forschung, bei der Tiermodelle werden verwendet, um die gesundheitlichen Auswirkungen der Exposition gegenüber Nanomaterialien zu bewerten ergänzen aktuelle und zukünftige hat. Anwendung dieses Verfahrens könnte auch nanoskalige Arzneimittelabgabe Forschung, die Gewebe oder Tiermodellen verwendet zu informieren. Insbesondere Nanopartikel-Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung im gesamten organs und Geweben konnte mit diesem System untersucht werden. Eine breite Vielfalt von Anwendungen für die Verwendung in der biomedizinischen Forschung 11 untersucht.
Dieses Verfahren könnte für die Beurteilung der verschiedenen biologischen Proben (wie beispielsweise verschiedene Arten Geweben, Bronchiallavage Proben und Blutausstrichen), die Nanopartikel aus einer Vielzahl von Elementzusammensetzungen 16-19 ausgesetzt worden sind, verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für die Untersuchung Nanopartikel Bioverteilung in vivo und in vitro, die einschlägigen für nanoskalige Arzneimittelverabreichungsstudien 11. Über biologische Proben kann EDFM und HSI verwendeten Nanopartikel in Umweltproben, wie beispielsweise Abwasser 20 auszuwerten. Berufliche Expositionsbewertung kann durch die Verwendung dieser Technik als auch erleichtert werden, denn es kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von persönlicher Schutzausrüstung bei der Verhinderung Nanopartikel Eindringen zu bewerten. Darüber hinaus wird die Forschung teUhr entwickelt derzeit eine ähnliche EDFM und HSI-Protokoll für die Bewertung der Filtermedien Proben von Nanopartikeln aus beruflichen Expositionsbewertungen gesammelt. Während Herstellung dieser verschiedenen Probentypen für EDFM und HSI kann variieren, ist es wichtig, dass sie in einer Weise, dass sie leicht durch das optische System visualisiert werden hergestellt. In der Regel sollte die Probe vorbereitet, als ob es über herkömmliche Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Es gibt mehrere hyperspektrale Bildgebungssysteme im Handel erhältlichen 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für Gewebeproben, die herkömmliche histologische Färbung, die Identifizierung und Analyse von Metalloxid-Nanopartikeln unterworfen wurden, durch eine Kombination von EDFM, HSI Mapping und Bildanalysetechniken erreicht werden. Während es die Flexibilität bei der Probenvorbereitung für die Histologie und Immunhistochemie (zB mit festen oder gefrorenen Geweben, die Art der Färbung), ist es wichtig, dass die Proben mit einer Dicke von 5-10 um für eine optimale Visualisierung geschnitten. Proben wurden hier mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten vor dem Schneiden mit einem Rotationsmikrotom bis 6 & mgr; m Dicke, die auf Glasobjektträgern angebracht, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und mit einem Deckglas. Schweinehautgewebe von einem Ex-vivo-Hautpenetrations Toxikologie Zusammenarbeit wurden für diese Studie verwendet. Die Gewebe wurden zu Metalloxid-Nanopartikel (Aluminiumoxid, Siliziumdioxid, Ceroxid) in wässrige Suspensionen belichtet. Der Nachweis der Region (en) von Interesse (hoher Kontrast elemeNTS) mit EDFM ist ein entscheidender erster Schritt, die nachfolgenden HSI-Mapping und Analyse erleichtert. Positive und negative Kontrollproben müssen abgebildet werden und zunächst analysiert, um eine spektrale Bibliothek für Referenz erstellen. Die gesammelten Spektren der Positivkontrolle mit einer positiven Steuerspektrenbibliothek exportiert. Dann werden alle Spektren der negativen Kontroll Bilder von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle ist, um die Spezifität zu verbessern subtrahiert (Fehlalarme zu reduzieren). Die sich ergebende gefilterte Spektrenbibliothek gilt als der RSL, die für die Analyse von Materialien von Interesse dient. Alle Gewebeproben durchlaufen die gleichen Abbildungsverfahren und gegen die RSL abgebildet. Das resultierende Bild wird nur Bereiche mit Elementen von Interesse über einen schwarzen Hintergrund enthalten. Dieses Bild könnte dann mit ImageJ mit seinen Schwellenwert und Partikelanalysefunktionen, die Fläche der abgebildeten Partikel pro Sichtfeld zu erhalten, analysiert werden. Von ImageJ erhaltenen numerischen Daten können Export seined in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse.
Es ist wichtig zu beachten, dass als biologische Proben sind von Natur aus unterschiedlich voneinander und Färbeverfahren kann Visualisierung durch EDFM und HSI beeinträchtigen, sollten die Belichtungseinstellungen entsprechend, was das beste Bild mit hohem Kontrast für eine bestimmte Art der Probe bestimmt werden. Obwohl Reduktion von Fehlalarmen durch die Filtration von Spektrenbibliotheken erreicht werden kann, ist es von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige negative Kontrollen, die Kontamination mit dem Element von Interesse vermieden werden können, zu erhalten, wie die Spektren entsprechend dieser Verunreinigung könnte möglicherweise von Spektrenbibliothek der positiven Kontrolle die gefiltert werden , die Erhöhung der falsch negativen Ergebnisse. Auch kann das Spektrum Intensitätsbereich, der mit der hyperspektralen Bildbearbeitungssoftware nachweisbar ist die Grenze der bestimmten Software nicht überschreiten (für diese Studie ist, dass 16.000 Einheiten): Gebiete mit einer hohen Anzahl von angesammelten Partikel, die sp produzierenectral Intensitäten über der Intensitätsgrenze werden aus der Spektrenbibliothek gelassen, da die Gefahr einer Erhöhung der Anzahl von falschen Negativen.
Während die HSI System verleiht viele Vorteile gegenüber traditionellen Verfahren gibt es einige Nachteile und Einschränkungen zu berücksichtigen. Einer ist, dass die große Menge von optischen Daten gesammelt werden, können erhebliche Rechenleistung erfordern. Ein weiterer Grund ist, dass HSI kann zeitintensiv sein, vor allem im Anfangsstadium, wenn Referenzspektrenbibliotheken werden geschaffen. Auch kann Bildgebungszeit mehrere Minuten pro Bildaufnahme erfordern, so dass es langsamer als einfache Dunkelfeld-Bildgebung; jedoch ist es immer noch schneller als eine Abtastung Herstellung und Visualisieren durch Elektronenmikroskopie. Zusätzlich können komplexe Systeme in mehreren charakteristische Spektren, die die Entwicklung von hochspezialisierten Kontrollen erfordern und machen die Einrichtung von standardisierten, Universalbibliotheken schwierigen 26 führen. Schließlich ist die Tech-nique zu einer geringeren Auflösung als Sonden- oder elektronenmikroskopische Techniken wie Rasterkraftmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie, die einzelne Atome auflösen kann. Auflösung dieses Verfahren ist begrenzt aufgrund seiner photonische Natur, die es entfernt, ein hochpräzises Instrument zur Messung der Partikelgrößen im Nanometerbereich oder für die präzise Platzierung von Materialien bei einer Sub-Mikrometer-Ebene verhindert. Während die Technik in der Lage, Partikel in bestimmten Gewebekammern oder Zellorganellen zu lokalisieren größer als 1 um (wie Zellkerne), kleiner Organellen oder Merkmale sind schwierig genau zu diesem Verfahren zu visualisieren. Auch der Hinweis, aufgrund seiner räumlichen Auflösung kann diese Methode nicht zwischen den einzelnen Nanopartikeln und Agglomerate 11 zu differenzieren.
Andere Überlegungen sind: bestimmte Materialien (zB Edelmetalle) haben viel höhere Reflektivität und unterschiedliche spektrale Profile, die machen sie leichter zu Analyze und spektral Karte mit diesem Tool. Andere, wie den Halbmetalloxide in dieser Studie untersucht und Kohlenstoff-Nanomaterialien 24, 27 kann eine größere Herausforderung aufgrund ihrer elementaren Zusammensetzung, Form haben, und in Abhängigkeit von der Matrix. In zwei murinen Inhalationsstudien von Mercer et al., Wurde ein ähnliches System, das in dieser Studie verwendet, um Kohlenstoff-Nanoröhren in der Lunge und in sekundäre Organe auf der Grundlage ihrer bemerkenswert hohen Kontrast mit umgebendem Gewebe zu lokalisieren verwendet. Jedoch wurde hyper Zuordnung nicht in beiden Studien zeigten, wahrscheinlich, weil die einzigartige Form von Kohlenstoff-Fasern war eine ausreichende Eigenschaft zur Identifizierung. Eine weitere Überlegung betrifft speziell auf Gewebe: seit Abscheiden Nanopartikeln interessieren bestimmten Organen durch normale biophysikalischen Prozesse unvorhersehbar ist (und oft selbst das Thema der Studie) kann die Bestimmung eines anwendbaren positive Kontrolle schwierig sein und erfordert Überlegung, wie Erzeugung des Steuer might beeinflussen den Zustand eines Materials von Interesse. Wenn beispielsweise ein Spektrenbibliothek aus unberührten Nanopartikel von Interesse erzeugt, kann es schwierig sein, um die Bibliothek zu denselben Nanopartikel in Geweben oder Zellen der Karte aufgrund von Änderungen in den Spektren von Veränderung des Teilchens (z resultiert, aufgrund einer Änderung in pH, Auflösung, Agglomeration, Proteinbindung) und die Gesamtmikroumgebung oder Matrix. Schließlich ist das Verfahren in seiner semi-quantitative Natur beschränkt: sie kann nur als quantitative andere zweidimensionale Mikroskopietechniken ähnlicher Auflösung, das heißt, sie kann nicht einfach verwendet werden, um Aufgaben wie die Charakterisierung Gesamtorgan Last eines Materials durchführen zu können.
Insgesamt EDFM und HSI bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Nano Bildgebung und Charakterisierungstechniken, wie TEM HAADF und DIC. EDFM / HSI ermöglicht eine schnellere Bildaufnahme und Analyse, die Zeit und Kosten spart im Vergleich zu intensiveren convenlen Techniken. Außerdem ist die Probenvorbereitung für EDFM / HSI typischerweise sowohl minimal als auch zerstörungsfrei, das spart Zeit und ermöglicht eine flexiblere Analyse einer bestimmten Probe, da es dann für andere Techniken eingesetzt werden. Weiterhin ist HSI vielseitig, so für die Analyse von nanoskaligen Materialien vieler Zusammensetzungen und in einer Vielzahl von Matrizen. Das Forscherteam arbeitet daran, die für andere Materialien und Probentypen, einschließlich einer eingehenden Beurteilung der Spezifität der Technik beschriebene Verfahren zu verfeinern. Eine kritische nächste Schritt untersuchte das Forscherteam ist die Validierung dieser Verfahren gegen die traditionelle Goldstandards (zB Raman, TEM, SEM) für die Materialien und Gewebetypen von Interesse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
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