חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

החזיר המקומי הפך להיות נושא מחקר בסיסי בפיתוח, גנטיקה ותזונה הן במגזרים האדם ואת בעלי החיים. הפוטנציאל של חזירים כמודלים ביו למחקר אנושי ניתן לייחס הדמיון הפיזיולוגי שלהם. ב בעלי חיים, מניפולציה של יחס מינים יכולים לשפר את האפקטיביות של תוכניות בחירה ושיפור גנטי ^1. זיהוי מין העוברים הפרט הוא כלי בסיסי המשמש בחקירות ניסיוני רבים, כולל אך לא מוגבל גנוטיפ, אפיגנטיקה X איון של dimorphism מינית במהלך ההתפתחות העובר המוקדם ^2.

מחקרים בעכברים מראים כי דיאטה אימהית וגורמים אחרים עלולים לגרום חוסר איזון בין מיני ^3. חזירים, הגורם לחוסר איזון יחס מינים כוללים גזע אבהי ^4, רחם קיבולת ^5, ותנאי המטבולית של החזירה ^6. מאז ההבדלים שנצפו עובר המלטות יכולים להיות מושפע sedimorphism xual, החוקרים צריכים להיות מודעים מין העובר ויחסי מין בהסקת מסקנות לגבי המחקר שלהם. פיתוחם של הכלים ופרוטוקולים יעילים זיהוי מין עובר חזיר יום 30 של פיתוח יידון כאן.

שיטות שונות של הקלדת מין פותחו למחקרים גנטיים באורגניזמים מודל ובעלי חיים. בעיקר בעלי חיים, זיהוי עובר זכר ונקבה מוקדם הוא נוהג נפוץ מאוד כדי לשפר את הבחירה גנטית תוכניות רבייה. עובריים מוקדם karyotyping ב חזיר באמצעות Giemsa ⁷ או טכניקות ^8,9 הקרינה האינטנסיבית שמש במשך הקלדת מין. עם זאת, שיטות אלו זמן רב ולא מתאים להקרנה מספר גדול של עוברים במהירות ובאופן מדויק.

שיטת הקלדת מין היעילה ביותר היא ההגברה DNA באמצעות DNA פולימרז יציבה חום זוג פריימרים. זיהוי מין באמצעים DNA בשיטת PCR הוא יותר ספציפי, מהיר ורגיש, only הדורשים כמות זעירה של חומרים הסלולר. זיהוי מין באמצעים העובר PCR מבוסס הראשונה בוצעה על בני אדם ^10, ומאוחר יותר בעכברים ^11, בקר ^{12, 13} תאו וכבשים ¹⁴ בעוברים בשלב טרום ההשתלה. ב החזיר, שיטת הקלדת DNA המין המוקדמת הוקמה עבור בעוברים בשלב טרום השתלה באמצעות זוג אחד של פריימרים DNA הספציפיים Y כרומוזום ^15. עם זאת, פריימרים PCR הנפוצים ביותר לקביעת מין נבחרו מתוך ה- Y כרומוזום של גן Sry ספציפי זכר ¹⁶ ובאזור המפלה שאינו המין של גן אבץ-אצבע הממוקם הוא X ו- Y כרומוזום ^17. בהמשך לכך, פריימרים אלה יושמו כדי לקבוע את המין של יום 30 עוברים במחקר זה עם סגוליות משופרים של פריימרים לזהות רק כרומוזום ה- X של גן אבץ-אצבע.

הדנ"א הגנומי מעוברת טרום השרשה חזירית ניתן לחלץ באמצעות חשיפת הבלסטוציסט שלם למאגר עם proteinasדואר K ¹⁶ או על ידי לקיחת ביופסיה של כמה תאים מן המחשוף מוקדם בודדים עוברים ¹⁵ והשימוש בהם עבור ישירה PCR. עם זאת, שחרור של דנ"א מהדם חזירי, שיער, רקמות או conceptus גדול על פני כמה סנטימטרים בגודל לא נעשה ביעילות בשיטת K proteinase. חילוץ שיטות DNA עבור חומרים אלה הוקמו באף זמן רב פרוטוקולי פנול / כלורופורם ⁶ או ערכות יקרות בהתבסס עמודה ^18. על מנת למנוע את השימוש בכימיקלים רעילים, קיימת מגמה לפתח שיטות מיצוי DNA זול, קל פנול-חינם. סוג זה של פרוטוקול לבידוד של הדנ"א הגנומי PCR באיכות מהעכבר ¹⁹ ו דג הזברה ²⁰ רקמות כבר נקבעה באמצעות נתרן הידרוקסידי חם טריס (hotshot). מחקר זה מספק פרוטוקול להשיג DNA עם זוגות פריימר דופלקס מאצ ו מחדש שונה לסקס PCR להקליד ישירות lysates התא של יום 30 עוברים חזירי עםדיוק גבוה.