Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR
Summary
This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.
Abstract
La recherche sur la programmation prénatale chez le porc a montré que le sexe de l'embryon ou du foetus peut influencer le résultat du développement. Par conséquent, la capacité de déterminer le sexe d'un embryon est nécessaire dans de nombreuses expériences en particulier en ce qui concerne le développement des jeunes. Le présent protocole démontre une préparation peu coûteuse, rapide et non-toxique de l'ADN génomique de porc pour une utilisation avec la PCR. Jour 30 embryons doivent être humainement collectées selon les lignes directrices établies par des institutions politiques relatives aux animaux et comités de protection pour le présent protocole. La préparation de l'embryon entier de cette technique basée sur la PCR de sexage consiste simplement en broyant le embryons congelés en une poudre fine en utilisant un mortier pré-refroidi et un pilon. ADN par PCR qualité est libéré à partir d'une petite quantité de poudre d'embryons par application d'une incubation à chaud dans un réactif de lyse alcaline. Ensuite, la solution d'ADN est mélangé avec un tampon de neutralisation et utilisé directement pour la PCR. Deux paires d'amorces sont générés pour DETECSexospécifiques t déterminer région du chromosome Y (SRY) et la région ZFX du chromosome X avec une grande précision et de spécificité. Le même protocole peut être appliqué à d'autres embryons allongés (de jour 10 et le jour 14) jours au plus tôt 30. En outre, ce protocole peut être réalisée avec des plaques de 96 jailli lors de la sélection d'un grand nombre d'embryons, ce qui rend possible pour l'automatisation et la haute débit typage sexe.
Introduction
Le porc domestique est devenue un sujet de recherche fondamentale dans le développement, la génétique et de la nutrition dans les deux secteurs de l'homme et le bétail. Le potentiel de porcs comme modèles biomédicaux pour la recherche humaine peut être attribuée à leurs similitudes physiologiques. Dans l'élevage, la manipulation de la sex-ratio peut améliorer l'efficacité de sélection et d'amélioration génétique des programmes 1. Sexage des embryons individuels est un outil fondamental utilisé dans de nombreuses études expérimentales, y compris, mais sans s'y limiter, le génotype, l'épigénétique et X inactivation du dimorphisme sexuel au début du développement embryonnaire 2.
Études chez la souris suggèrent que le régime alimentaire de la mère et d'autres facteurs peuvent entraîner un déséquilibre entre les sexes 3. Chez les porcs, les causes de sex-ratio déséquilibre comprennent race paternelle 4, la capacité de l'utérus 5, et l'état métabolique de la truie 6. Étant donné que les différences observées dans les embryons et les portées peuvent être influencés par soixual dimorphisme, les chercheurs doivent être conscients de l'embryon de sexe et les rapports sexuels avant de tirer des conclusions au sujet de leur recherche. Le développement d'outils et de protocoles efficaces pour le sexage des embryons de porcs au jour 30 du développement sera discuté ici.
Diverses méthodes de typage du sexe ont été développés pour les études génétiques chez les organismes modèles et le bétail. En particulier dans l'élevage, l'identification des embryons précoces, hommes et femmes est une pratique très courante pour améliorer la sélection génétique pour les programmes de sélection. Embryons précoces caryotype chez le porc en utilisant Giemsa 7 ou la fluorescence intense 8,9 techniques ont été utilisées pour le typage de sexe. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et ne conviennent pas pour le criblage de grands nombres d'embryons rapidement et avec précision.
Le procédé de typage de sexe le plus efficace est l'amplification d'ADN en utilisant une ADN polymérase stable à la chaleur et une paire d'amorces. ADN sexage par la méthode PCR est plus spécifique, rapide et sensible, onécessitant eul une infime quantité de matériaux cellulaires. La première sexage des embryons par PCR a été effectuée sur des êtres humains 10, et plus tard chez la souris 11, les bovins, les buffles 12 13 et 14 moutons embryons pré-implantatoire. Chez le porc, la méthode de typage de l'ADN du sexe plus tôt a été établi pour les embryons de pré-implantation par une seule paire de chromosome Y amorces d'ADN spécifiques 15. Cependant, des amorces de PCR les plus courantes pour la détermination du sexe ont été choisis dans le chromosome Y du gène SRY spécifique mâle 16 et la non-sex région discriminante d'un gène à doigt de zinc située à la fois X et Y chromosome 17. Par la suite, ces amorces ont été appliqués pour déterminer le sexe d'embryons du jour 30 dans la présente étude avec une meilleure spécificité des amorces pour détecter uniquement le chromosome X d'un gène à doigt de zinc.
L'ADN génomique de porc embryons pré-implantation peut être extraite par l'exposition d'un blastocyste intact pour tamponner avec proteinase K 16 ou en prenant une biopsie de quelques cellules de la coupure rapide individuelle embryons de 15 et de les utiliser pour la PCR directe. Cependant, la libération de l'ADN à partir de sang de porc, les cheveux, les tissus ou une grande conceptus sur quelques centimètres dans la taille est pas effectivement fait en utilisant la méthode protéinase K. Méthodes d'extraction de l'ADN de ces matériaux ont été créés en utilisant soit chronophages protocoles phénol / chloroforme 6 ou des kits basés colonne coûteuse 18. Afin d'éviter l'utilisation de produits chimiques potentiellement toxiques, il y a une tendance à développer des méthodes d'extraction d'ADN faciles et sans phénol peu coûteux. Ce type de protocole pour l'isolement de l'ADN génomique par PCR qualité de la souris 19 et de poisson zèbre 20 tissus a été établie à l'aide d'hydroxyde de sodium chaud et Tris (champion). Cette étude fournit un protocole pour obtenir de l'ADN avec des paires d'amorces duplex modifiés champion et redessinés pour le sexe PCR tapant directement à partir de lysats cellulaires de Jour 30 embryons de porc avechaute précision.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plupart des protocoles existants en matière de sexe porcine typage de l'ADN des embryons ne conviennent qu'aux stade précoce stade pré-implantatoire 15,16. Nous avons développé avec succès un protocole approprié pour le dépistage des embryons de porc en fin de gestation. Basé sur des études avec des stades de développement similaires d'embryons provenant d'études précédentes 6,18, le présent protocole est considéré comme plus sûr et à faible coût.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner la collaboration et les contributions financières de l'agence de financement de la recherche suivante: Alberta bétail et des viandes Agency Ltd, porc CRC, Alberta Pork, Hypor A Hendrix Genetics Company et le CRSNG CRSNG.
Materials
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used – quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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