Nauwkeurige en Fenol Gratis DNA Sexing van Dag 30 embryo's van varkens door PCR

De binnenlandse varken is een fundamenteel onderzoek onderwerp in ontwikkeling, genetica en voeding in zowel menselijke en dierlijke sectoren geworden. Het potentieel van varkens biomedische modellen voor menselijke onderzoek kan worden toegeschreven aan de fysiologische gelijkenissen. In vee, kan de manipulatie van sex-ratio van de effectiviteit van de selectie en genetische verbeterprogramma's ¹ te verbeteren. Geslachtsbepaling individuele embryo is een fundamenteel gereedschap in vele experimentele onderzoeken waaronder maar niet beperkt tot genotype, epigenetica en X inactivatie van geslachtsdimorfisme tijdens de vroege embryonale ontwikkeling ^2.

Studies in muizen wijzen erop dat de moeder voeding en andere factoren kunnen leiden tot genderongelijkheid ^3. Bij varkens oorzaken van sex-ratio onbalans onder vaderlijke ras ^4, baarmoeder capaciteit ^5, en de zeug metabole ^voorwaarde 6. Waarbij de verschillen waargenomen in embryo's en nesten kan worden beïnvloed door sexual dimorfisme, moeten onderzoekers zich bewust zijn van embryo sex en sex ratio's alvorens conclusies te trekken ten aanzien van hun onderzoek. De ontwikkeling van efficiënte instrumenten en protocollen voor geslachtsbepaling varken embryo's op dag 30 van de ontwikkeling zal hier worden besproken.

Verscheidene werkwijzen van geslacht typen zijn ontwikkeld voor genetische studies in modelorganismen en vee. Met name in de veehouderij, het identificeren van de mannelijke en vrouwelijke vroege embryo's is een veel voorkomende praktijk genetische selectie te verbeteren voor fokprogramma's. Vroege embryo karyotypering in varkens gebruik Giemsa ⁷ of intense fluorescentie ^8,9 technieken gebruikt voor seks typen. Deze werkwijzen zijn tijdrovend en niet geschikt voor het screenen van grote aantallen embryo's snel en nauwkeurig.

De meest effectieve sex typeringsmethode DNA amplificatie met behulp van een warmtestabiel DNA polymerase en een paar primers. Geslachtsbepaling DNA door PCR methode is specifiek, snelle en gevoelige, olleen die een minieme hoeveelheid van cellulaire materialen. De eerste PCR-gebaseerde embryo geslachtsbepaling werd uitgevoerd op mensen ^10, en later in muizen ^11, vee ^12, buffels ^{13 en 14} schapen pre-implantatie embryo's. In het varken, werd de eerste DNA geslacht typeringsmethode vastgesteld voor pre-implantatie embryo's via een enkel paar Y-chromosoom specifieke DNA primers ^15. Echter, de meest voorkomende PCR primers voor geslachtsbepaling werden geselecteerd uit het Y-chromosoom specifieke mannelijke SRY gen ¹⁶ en de niet-sekse discriminerende gebied van een zinkvinger gen aan beide X- en Y-chromosoom ^17. Vervolgens werden deze primers toegepast op het geslacht van dag 30 embryo's in deze studie met een verbeterde specificiteit van de primers bepaalt alleen de X- chromosoom van een zinkvinger gen detecteren.

Genomisch DNA uit varken pre-implantatie embryo kan worden geëxtraheerd door het blootstellen van een intact blastocyst buffer met proteinase K ¹⁶ of door middel van een biopsie van een aantal cellen van het individu vroege embryo splitsing ¹⁵ en het gebruik voor directe PCR. Echter, introductie van DNA uit varkensbloed, haar, weefsel of een grote conceptus over enkele centimeters groot is niet effectief gedaan met behulp van proteinase K methode. DNA-extractie voor deze materialen werden vastgesteld met behulp van tijdrovende fenol / chloroform protocollen ⁶ of dure kolom gebaseerde kits ^18. Om het gebruik van potentieel toxische stoffen te vermijden, is er een trend om goedkoop, eenvoudig en fenol-vrij DNA extractie te ontwikkelen. Dit type protocol voor de isolatie van PCR-kwaliteit genomisch DNA van de muis ¹⁹ en ²⁰ zebravis weefsels werd vastgesteld met behulp van hete natriumhydroxide en Tris (HOTSHOT). Deze studie geeft een protocol om DNA te verkrijgen met gemodificeerde hotshot en vernieuwde duplex primerparen voor de PCR sex direct te typen van cellysaten van de Dag 30 embryo's van varkens methoge nauwkeurigheid.