Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Adenovirus contengono un genoma a doppio filamento di DNA che si replica nel nucleo della cellula infetta. Quando il DNA virale entra nel nucleo, localizza adiacente PML corpi nucleari 1. A seguito di espressione genica virale precoce, l'architettura nucleare è drammaticamente riorganizzato, inducendo la formazione di microambienti virali, chiamato Compartimenti replicazione virale (RC) 2. Dal adenovirus (Ad) RC sono i siti dove la replicazione virale e l'espressione del genoma di geni virali in ritardo si svolgono, forniscono un ambiente per l'assunzione di tutti i fattori virali e cellulari necessari che partecipano a questi processi. È interessante notare che una varietà di proteine cellulari responsabili per la risposta antivirale cellulare, come risposta al danno del DNA, la risposta immunitaria innata e soppressione del tumore sono co-scelto di questi siti virali 2. Mozzi normativi Quindi, Annuncio RC può essere considerato che promuovono la replicazione virale efficiente, in concomitanza regolazione delrisposta antivirale cellulare, indicando che queste strutture sono la chiave per la comprensione delle interazioni delle cellule virus-ospite. Tuttavia, i meccanismi molecolari della formazione di RC, la loro composizione e le attività connesse sono poco conosciute.
Adenovirale RC, nonché RC da altri virus DNA che si replicano nel nucleo non sono associati alle membrane, in contrasto con RC citoplasmatica 3. Inoltre, queste strutture virus indotta sono suscettibili di essere composto interamente di proteine e acidi nucleici. RC formata in cellule infettate con virus a RNA (di solito chiamato fabbriche virali) sono stati isolati, approfittando della loro localizzazione citoplasmatica e lo status di membrana, che ha facilitato il loro morfologica dettagliata, caratterizzazione funzionale e biochimico 4.
A nostra conoscenza, RC virale nucleare non sono stati isolati, forse a causa della complessità dell'architettura nucleare e assenza di m intranucleariembranes che potrebbero agevolare il loro isolamento. Il loro studio si è basata invece su immunofluorescenza, FISH e microscopia elettronica a trasmissione. Tuttavia, nonostante le complicazioni inerenti a isolare strutture subnucleari, altri domini nucleari come nucleoli ed Enti Cajal sono stati isolati prima di 5,6. Poiché nucleoli e RC sono entrambi composti di proteine e acidi nucleici, e hanno un diametro compreso tra 0,5 – 5 micron, abbiamo ipotizzato che RC dovrebbe anche essere suscettibili di isolamento. Pertanto, al fine di caratterizzare più precisamente la composizione molecolare e funzioni associate RC, abbiamo stabilito un nuovo metodo per isolare frazioni subnucleari arricchite con telecomando. A tal fine, abbiamo preparato sub-nucleare frazioni utilizzando gradienti di velocità e cuscini saccarosio simili a procedure utilizzate per isolare nucleoli 7 o altri domini nucleari 6 e stabilito un sistema non cellulare che permette lo studio della composizione molecolare e le attività connesse diRC. Questa tecnica dovrebbe quindi avanzare la comprensione delle interazioni delle cellule virus e ospite e rappresenta un potente strumento che dovrebbe anche facilitare l'analisi dettagliata di RC da altri virus che si replicano nel nucleo e indurre la formazione di compartimenti replica di dimensioni simili a quelle costituite in adenovirus- cellule infettate, come, herpesvirus, papillomavirus o poliomavirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
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