בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Adenoviruses מכיל הגנום גדילי דנ"א כפול שמשכפל בגרעין התא הנגוע. כאשר ה- DNA הנגיפי נכנס לגרעין, זה localizes סמוך לגופים גרעיניים PML 1. בעקבות ביטוי גנים נגיפי מוקדם, הארכיטקטורה הגרעינית היא מחדש באופן דרמטי, וישכנע היווצרות של מייקרו-סביבות נגיפיות, המכונה תאים לנגיפיים שכפול (RC) 2. מאז אדנווירוס RC (מודעות) הם אתרים שבם שכפול הגנום נגיפי וביטוי של גנים נגיפיים מאוחר יתקיימו, הם מספקים סביבה לגיוס של כל הגורמים הנגיפיים וסלולריים הצורך המשתתפים בתהליכים אלה. מעניין, מגוון רחב של חלבונים תאיים אחראים לתגובה אנטי הסלולרית, כגון תגובת הנזק לדנ"א, התגובה החיסונית המולדת ודיכוי גידול הם לאתרים הנגיפיים אלה 2 נבחרים. רכזות רגולציה מכאן, יכול להיחשב מודעות RC המקדמות שכפול נגיפי יעיל תוך הסדרה במקבילתגובה תאית אנטי, מצביעה על כך שהמבנים אלה הם מפתח להבנת אינטראקציות תא-מארח וירוס. עם זאת, המנגנונים המולקולריים של היווצרות RC, הרכבם והפעילויות נלוות הם הבינו היטב.
Adenoviral RC, כמו גם RC מוירוסים DNA אחרים שלשכפל בגרעין אינם קשור לקרומים, בניגוד לRC cytoplasmic 3. יתר על כן, מבנים מושרה וירוס אלה עשויים להיות מורכבים כולו מחלבונים וחומצות גרעין. RC נוצר בתאים נגועים בווירוסי RNA (בדרך כלל מכונה מפעלים נגיפיים) היה מבודד, מנצל הלוקליזציה שלהם cytoplasmic ומעמד קרום הנכנס, אשר הקלה המורפולוגיות מפורטות שלהם, אפיון פונקציונלי ויוכימיים 4.
למיטב ידיעתנו, RC הנגיפי גרעיני לא היה מבודד, אולי בשל המורכבות של הארכיטקטורה והיעדר הגרעיניים של מטר intranuclearembranes שיאפשר בידודם. מחקרם הסתמך במקום על מיקרוסקופיה immunofluorescence, דגים ומיקרוסקופים אלקטרונים הילוכים. עם זאת, למרות סיבוכים הגלומים לבידוד מבני subnuclear, תחומים גרעיניים אחרים כגון nucleoli וגופים קחל היו מבודדים לפני 5,6. מאז nucleoli וRC שניהם מורכבים מחלבונים וחומצות גרעין, ויש קוטר בין 0.5-5 מיקרומטר, שערנו כי RC צריך להיות גם נוח לבידוד. לכן, על מנת לאפיין את ההרכב המולקולרי ופונקציות הקשורות לRC מדויק יותר, הקמנו שיטה חדשה לבודד את השברים subnuclear מועשרים בRC. לשם כך, אנחנו מוכנים שברים תת-גרעיני באמצעות הדרגתיים מהירות וכריות סוכרוז דומה לנהלים המשמשים לבודד nucleoli 7 או תחומים גרעיניים אחרים 6 והקמנו מערכת תא ללא שמאפשרת הלימוד של ההרכב המולקולרי ופעילויות הקשורות לRC. טכניקה זו ולכן צריכה לקדם את ההבנה של אינטראקציות תא-מארח וירוס ומהווה כלי רב עוצמה שצריכה גם להקל על הניתוח מפורט של RC מוירוסים אחרים שלשכפל בגרעין ולגרום להיווצרות של תאי שכפול של ממדים דומים לאלה שנוצרו בadenovirus- נגועים בתאים, כגון, herpesviruses, papillomaviruses או polyomaviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).
- Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).
- Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment. J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).
- Busch, H., et al. Isolation of Nucleoli. Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).
- Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).
- Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. The nucleolus. J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).
- Groitl, P., Dobner, T. Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants. Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).
- Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology. 128, 480-484 (1983).
- Leppard, K. N. Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein. J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).
- Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts. J. Virol. 80, 964-974 (2006).
- Castillo-Villanueva, E., et al. The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection. ISRN Virology. 2014, 14 (2014).
- Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter. J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).
- Wright, J., Leppard, K. N. The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53. J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).
