이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델
Summary
Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.
Abstract
적응성 면역 T 세포와 항원 제시 세포 ( '장갑차') 사이의 동적 인 상호 작용에 의해 조절 '면역 시냅스'라 칭한다. 이러한 친밀한 세포 – 세포 인터페이스 내에서 MHC / AG-TCR, F – 굴지, 접착의 개별 하위 세포 클러스터 및 신호 분자가 형성 빠르게 개조. 이러한 역학은 중요한 효율성과 개발 면역 반응의 품질 모두의 결정 때문에 병리학 적 면역 대 보호의 것으로 생각된다. 생리적 장갑차와 면역 시냅스의 현재 이해는 얻을 수있는 영상 해상도의 무능력에 의해 제한된다. 인공 기판 모델 (예를 들면, 평면 지질 이중층)이 우수한 해상도를 제공하며 매우 유용한 도구되었을지라도, 이들은 본래 비 생리적 및 과도하게 단순화된다. 혈관과 림프 내피 세포는 '반 직업의 중요한 말초 조직 (또는 기질) 구획으로 등장알 장갑차 '. (전문 장갑차의 분자 기계의 대부분을 표현할)이 거의 평탄한 장갑차 세포 표면을 형성하는 독특한 특징을 갖고 (형광성 단백질 리포터로, 예) 형질 용이하다. 여기서 기본 접근법을 설명한다 신규하고 개선 된 이미징 및 항원 기본적인 시그널링 프로세스 심문 생리적 '평면 셀룰러 APC 모델'내피 세포 등을 구현한다.
Introduction
T 림프구는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 효율적으로 결합 된 펩티드 항원은 (Ag)을 인식하는 능력을 특징으로 적응 면역계의 분기 아르는 T 세포 수용체 (TCR도 1)를 통해 분자. 나이브 림프구 구조적 마이그레이션 '전문의 Ag 제시 세포'(장갑차; 예 : 수지상 세포)을 주사 메모리 / 효과기 T 세포가 효과적으로 말초 조직 내의 장갑차 및 잠재 표적 세포의 매우 넓은 범위를 조사 할 필요가 있지만, 림프절 내.
APC에 동족의 Ag의 최초 인식 다음 분에서 자신의 마이그레이션을 체포하고 전문 친밀한 세포 – 세포 인터페이스라고 '면역 시냅스'를 형성하기 시작 림프구 (IS). 지속 (즉, 30 ~ 60 분) 접점이 증폭 2-7 신호를 유지해야한다. 새로운 연구는 IS 내에, 그것이 연속 형성하고 신속한 R이라고 파악강도와 면역 반응 2-7 결과의 품질을 결정 (즉, MHC / AG-TCR, F – 굴지, 접착 및 신호 분자를 포함) 이산 서브 셀룰러 신호 마이크로 클러스터의 emodeling. 그러나, 이러한 방법의 세부 사항 및 동적 규제기구는 불완전 8,9 이해된다. 이것은 근본적으로 필요한 시공간 촬상 제한 APC 표면의 불규칙한 토폴로지 및 세포 – 세포 상호 작용의 저조한 제어 평면 배향, 이슈와 관련된 기술적 인 과제는 크게 기인하는 80-10 (Figure1A)에 접근한다.
이미징 면역 시냅스 역학 그림 1. 생리적 평면 셀 APC 모델은. 회로도는 T 세포와 professio 사이의 면역 학적 시냅스의 전통적인 이미지를 보여 NAL APC (A)와 T 세포와이 신규 한 내피 평면 APC 모델 (C)에 비해 전통적인 평면 지질 이중층 APC 모델 (B). ,, 극적으로 즉, 공간 (Z 영상 플레인의 해상도 ~ 1 ㎛) 및 시간을 (타협, 전문 장갑차는 생리적 면역 시냅스를 제공하지만 (해상도 ~ 0.2 μm의 최적의 XY 영상 평면에 대한 즉,) 제대로 지향 세포 – 세포 인터페이스를 제공 필요에 의한 반복적으로 영상의 해상도) 모든 Z 영상면을 스캔합니다. 이중층 모델 시공간 최적 이미징 해상도를 제공 평면 위상을 가질뿐만 아니라, 고도의 비 – 생리 학적 및 강성 간략화된다. 이것은 내피 세포 모델 생리적 환경에서 최적의 공간 및 시간 해상도 이미징을 제공하는 APC의 고전 생리적 기판과 지질 이중층의 평면 위상을 결합한다.M / 파일 / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이전의 연구는 부분적으로 최적의 XY 촬상에 평행 한 평면으로 T 세포의 활성화 표면 고정을 통해, 즉, 최적의 시공간 해상도 (제공 현상 평면 기판 모델 (즉, 지질 이중층과 항체 – 코팅 된면)에 의해 이러한 장애물을 회피했다 평면) 11 ~ 15 (그림 1B). 이러한 모델은 동적 액틴 / TCR 신호 마이크로 클러스터 7,11-14의 발견을 포함하여 T 세포에 항원 신호를 제어하는 분자 / 세포 내 역학에 중요한 통찰력을 촉진하고있다. 그러나, 이러한 모델은 본질적으로 과도하게 단순화되고,뿐만 아니라 강성 (도 1b) (3 차원 기하학적 특징의 개발 / 연구를 배제). 따라서, PHY에 그러한 결과를 연관시키는 방법 불확실siologic 세포 – 세포 면역 감시.
여전히 파악 하였다 있지만, 혈관과 림프 내피 세포가 큰로서 등장하고있다 (즉, ~ 1,000 배의 모든 전문 장갑차보다 숫자에 큰) '세미 프로'장갑차 16-18의 주변 함. (예를 들어, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1,하지만 CD80 및 CD86)이 세포는 MHC-I-, MHC-II-공동 자극 분자의 군중을 표현하고 전략적입니다 그들은 전문적인 감시 기능 16-18를 제공 혈액 조직 인터페이스에 위치. 이전의 연구에서는 내피 세포가 효율적으로 효과기 / 메모리 있지만 나이브 아니라 T 세포 19-25 다시 자극 할 수 있음을 입증 하였다. 따라서, 내피 세포는 T 세포 활성화, 분화, 메모리 및 공차 16,17,26 로컬 영향력 말초 조직 내의 적응성 면역 반응의 이펙터 단계에 고유 APC의 역할을하는 것으로 보인다. 크리시험 관내에서 배양 학적 때, 내피 세포는 사실상 평면 세포 표면을 형성하고 (형광 단백질 기자 예) 형질 용이하다. 이러한 기능은 세포 – 세포 상호 작용 19,27 동안 위상 역학의 높은 시공간 해상도 이미징에 이상적입니다. 따라서 내피 세포는 응답 (그림 1C) (19, 20)를 항원 인식을 운전하고 조절하는 분자 / 세포 내 리모델링 메커니즘 연구를위한 뚜렷하게 적합 생리적 '평면 세포 APC'모델이 될 수 있습니다.
이전 접착 및 transendothelial 마이그레이션 27시 백혈구 – 내피 상호 작용의 세부 사항을 공부 (세포막과 세포질의 형광 단백질 업체들과 내피 세포의 형질 전환 포함) 보완 이미징 기술을 설립, 백혈구가 적극적으로 동적으로 내피 세포의 표면을 검사 것으로 나타났다 삽입서브 마이크론 규모의 D 후퇴는 굴지 풍부한 원통형 돌기 (~ 직경과 깊이 200 ~ 나노 미터)는 invadosome 형 돌기 (즉, 'ILPs') 27, 28라고합니다. 이 촬상 방법은 상기보고 (19, 20)와 같은 T 세포 – 내피 면역 시냅스 높은 시공간 해상도의 영상화를위한 첫번째 방법을 개발하기 위해 내피 APC 기능을 활용 여기서는 더 설명하는 프로토콜들의 생성에 따라 확대되었다. 이 신규 한 평면 셀룰러 APC 모델로부터 유도 중앙 결과는 T 세포의 Ag ILPs 초기 탐지를 촉진 및 후속 시그널링을 모두 유지하는 기능을한다는 것이다. 실제로, (안정화 및 칼슘 플럭스 초기에 대응하여 발생한되었다), TCR 및 활성 신호 등 PKC-Q, ZAP-70, 포스 및 HS1의 암시 분자 쇼 농축 여러 ILPs의 배열. 따라서 ILPs는 TCR 시그널링에 마이크로 입체 생리적 등가를 나타내는 것평면 이중층 모델에서 본 클러스터. 이 방법은, 따라서 민감하게 밝혀 / 보고서 분자 및 건축 (및 생체 역학 묵시적) 역학 그렇지 않으면 감지되지.
본원에 기재된 방법은 적응성 면역 반응의 기본 메커니즘을 심문하는 능력을 향상시키기 위해 전문 APC 인공 APC 기판 모델 사이의 갭을 가교에 유용 할 것이다. 여기서 포커스는 CD4 +받은 Th1 형 이펙터 / 메모리 셀의 활성화에 있지만 후술하는 바와 같이,이 기본 방법은 용이하게, T 세포 유형 및 Ag로 광범위한 연구를 수정할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전반적으로,이 프로토콜은 I) 파악 하였다 생리적 장갑차로 내피 세포를 조사하기위한 방법을 설명하고, II) '평면 세포 APC 모델'의 새로운 유형으로. 전자와 관련하여, 이는 점차 적응 면역 반응을 형성하는데 16-18 (조혈 장갑차에 비해, IE)를 둘레 비 조혈 (또는 '기질') 장갑차 중요한, 비 중복 역할을하는 것으로 인식되고있다. 이러한 '세미 프로'장갑차, 혈…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).
Materials
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
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