Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Alle procedures hieronder beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd en uitgevoerd onder gesteriliseerde omstandigheden. 1. Wijziging van de GL261 cellen met vuurvliegluciferase Uiting Reporter OPMERKING: HIV-1-gebaseerde lentivirale vectoren tot expressie vuurvlieg luciferase (Fluc) onder controle van de milt focus vormende virus (SFFV) promoter. De optische reporter gen is gekloneerd in de vector plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. Handhaaf 293-T-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en GL261 cellen in RPMI medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 95 % lucht en 5% kooldioxide (CO 2). Wanneer de 293-T celkweek bereikt 80% confluentie in een T-75 kolf, was de cellen eenmaal met phosphate buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 3 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins schuin en verzamel alle cellen van de bodem van kolf. Breng de 3 ml trypsine celsuspensie in een 15 ml conische buis en voeg 7 ml vlees RPMI medium (in totaal 10 ml van de celsuspensie). Meng de celsuspensie goed met een pipet 5 ml. Neem 100 ul van de celsuspensie uit de buis en tel het aantal cellen met behulp hemocytometer. Hiervoor mix 100 ul van de celsuspensie met 300 pi trypan blauwe oplossing en voeg 2 pl van het mengsel in een hemocytometer. Tel het aantal cellen zonder blauwkleuring vier verschillende weergaven onder een microscoop. Het gemiddelde aantal cellen van elke weergave, omdat dit getal vertegenwoordigt 10 4 cellen / ml. Ondertussen, centrifugeer de buis met de celsuspensie bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 cellen met 2,5 ml RPMI-medium in een T-175 kolf met 27,5 ml DMEM (dag 1). Na 24 uur, vervang het medium met 20 ml vers DMEM (dag 2). Om de lentivirale vector produceren, meng 54 pl transfectie reagens met 2 ml serumvrij DMEM gedurende 5 min. Voeg 3 ug gag-pol, 3 ug van vesiculaire stomatitis G envelope (VSV-G), en 4,5 ug Fluc (pSIN-Fluc) in de DMEM met transfectie reagens en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Laat de gehele DNA-mengsel in 293-T kolf (T-175) en incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 48 uur (dag 2). Voeg 10 ml vers DMEM bij 24 uur na transfectie (totaal volume van 293-T celkweekmedium moet ongeveer 30 ml) (dag 3). Om GL261 cellen gesplitst in een24-wells plaat, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 5 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins gehelde Verzamel de cellen van de bodem van de kolf, en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2. Ondertussen, centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 cellen met 1 ml RPMI medium in een 24-well plaat (dag 3). Verzamel 30 ml van de lentivirale supernatant met 10 ml pipet uit de 293-kolf T (T-175) en 48 uur na transfectie en overdracht van de supernatant in 50 ml conische buis. Zuig het lentivirale 30 ml bovenstaande vloeistof via een injectiespuit 50 ml, door een 0,22 urn spuitfilter en aliquot het virale supernatant in 1 ml aliquots (dag 4). Vervang 1 ml RPMI middelmatige GL261 celplaatelektrode (24 putjes) met 1 ml van het supernatant lentivirale en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde kamer (dag 4). Na 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 6). Na 24 uur, herhaal de lentivirale infectie van de GL261 cellen (dag 7). Na de 2 e 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 9). Blijf de luciferase gemodificeerde GL261 cellen groeien (hierna aangeduid als GL261.luc cellen) en vergroten de celkweek aan een T-75 kolf. Wanneer de GL261.luc celkweek bereikt 70% confluentie in een T-75 kolf oogst van de cellen door behandeling met trypsine en tellen met een hemocytometer zoals in stap 1,2. Plate de GL261.luc cel in een 24-wells plaat bij afstuderen dichtheden (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellen / putje) en incuberen bij 37 ° C in een luchtbevochtigerfied kamer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet cellulaire luciferase activiteit ten opzichte Luciferase gemodificeerde U-87 MG (U87.luc) cellen met behulp bioluminescentie (figuur 1). Start de afbeelding software (klik op het pictogram op het bureaublad) en initialiseer de imaging-systeem (klik op "Initialize" knop). Initialisatie begint automatisch en kan enkele minuten duren voordat het systeem check-up en de camera afkoelen tot -90 ° C. Voeg 25 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) in elk putje. Incubeer de cellen met luciferine gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en de plaat voor 10 sec. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "10 sec" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de 24-well plaat op de imaging-station en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten. Nadat het beeld met succes is overgenomen, zal u een beeld venster en het gereedschap pa zienlette op het scherm. Klik op "ROI (regio's van belang) Tools" en selecteer 6 x 4 van het pictogram spleet. Maak 6 x 4 spleten aan de oppervlakte van het signaal op het imago van de 24-well plaat bedekken en klik op het tabblad metingen (potloodje). Observeren een venster met een lijst van ROI metingen eenheid van fotonen per seconde per steradiaal per vierkante cm (fotonen / sec / sr / cm2). Gebruik U87.luc cellen, eerder bewerkt met dezelfde lentivirus hier gebruikt voor GL261 modificatie 11, als een controle voor de beoordeling van luciferaseactiviteit in getransduceerde GL261.luc cellen. 2. In vitro Proliferatie assay Wanneer de GL261 en GL261.luc celculturen 70% confluentie bereiken in een T-75 kolf oogsten beide cellijnen door behandeling met trypsine en tellen als in stap 1,2, en plaat cellen in een 96-putjesplaat met een dichtheid van 1500 cellen in 80 ul van RPMI medium per putje met behulp van een multichannel pipet om tijd en pipetteren fouten te minimaliseren. Seed elke cellijn in 20 putten totaal. De verdamping in de putjes bevolkt door cellen te beperken, vul lege putjes met 100 pl vers RPMI medium. Beoordeel de cellulaire proliferatie met behulp van een colorimetrische celproliferatie assay. Hier gebruiken we de MTS-celproliferatie assay. Een multi-kanaal pipet wordt 20 pl MTS reagens in elk putje van de 96-well plaat die de cellen bevat. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet absorptie bij 490 nm met behulp van een microplaat reader. Dit wordt herhaald op dag 1, 2, 4 en 7 na plating. Om absorptiewaarden normaliseren, worden de waarden van elke dag gedeeld door de overeenkomstige waarden verkregen op dag 1 (Figuur 2). 3. Tumor Cell Implantatie Opmerking: Autoclaaf alle apparatuur. Bereid chirurgische gebied door het sproeien van een ontsmettingsmiddel (2% chloorhexidine oplossing) en bedek met absorbent gordijnen. Om steriele omstandigheden te handhaven, dragen steriele chirurgische handschoenen tijdens de operatie, en verdeel de chirurgische gebied in twee gebieden door kleur tape. Area 1 wordt het label "schoon" en bevat gesteriliseerd leveringen; Area 2 is gelabeld "vuile" en bevat gebruikte materialen. Voorafgaand aan chirurgie dier, bereiden een celsuspensie voor intracraniale injectie. Oogst cellen uit een 70% confluente T-75 kolf door behandeling met trypsine en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2, en een celsuspensie bij een dichtheid van 1,0 x 10 5 cellen / gl in Hanks 'uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg 2+ (HBSS). Verdoven muizen met intraperitoneale injectie van 200 pi mengsel dat 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine in 0,9% zoutoplossing. Om een ​​goede verdoving te bevestigen, knijp de teen van de muis. Als de muis volledig onder narcose moet de muis niet reageert op de stimulus. Toedienen van 0,1 mg / kg buprenorfine via subcutane injectie aan de postoperatieve pijn te verlichten. Scheren de bovenkant van het hoofd van de dieren met behulp van klippers en schoon met een katoenen tip applicator gedoopt in 2% chloorhexidine-oplossing. Gelden oogzalf om adequate smering tijdens de operatie te behouden. Maak een sagittale incisie ongeveer 1 cm lang over de parietooccipitalis bot met een steriele scalpel. Om de bregma visualiseren, veeg het oppervlak van de schedel met een katoen-tip applicator gedrenkt in een 3% waterstofperoxide-oplossing. Boor de schedel met een steriele 25-G naald een klein gat 3 mm rechts van de bregma en net achter het coronale hechtdraad maken. Opdat intracraniële injectie is tot een diepte van 3 mm van de schedel, cut 3 mm van de punt van een 20 ul pipetpunt met een schaar en plaats een injectiespuit in de pipetpunt. Steek de spuit loodrecht op het gat eerder gemaakte, en injecteer langzaam de tumorcel suspensioen met 3,0 x 10 5 cellen in 3 ul HBSS, over een periode van 1 min. Laat de naald in de plaats voor nog een minuut, en dan langzaam trek de naald. Zwabberen de schedel met katoen-tip applicator gedoopt in 3% waterstofperoxide en de 2% chloorhexidine-oplossing. Droog het oppervlak van de schedel met de katoen-tip applicator. Knip de steriele bot was ongeveer 3 mm 3 in grootte en bevestig het bot was op het einde van het katoen-tip applicator. Breng de been was om het gat met de katoen-tip applicator dekken. Teken de beide zijden van de hoofdhuid elkaar via schedel behulp van een tang en nieten om de wond te sluiten. Reinig de wond met een katoen-tip ondergedompeld in 2% chloorhexidine-oplossing. Monitor alle muizen post-operatief totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Gewoonlijk hersteltijd bedraagt ​​ongeveer 30 minuten. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. <p class = "jove_title"> 4. Bioluminescentie beeldvorming van GL261 tumorgroei Spray een ruime hoeveelheid ontsmettingsmiddel (0,05% dimethyl ammoniumchloride-oplossing) op een schone papieren handdoek. Gebruik de-desinfectiemiddel gedrenkte papieren handdoek grondig vegen de zwarte plaat, neus kegels en verdeler in de beeldvorming kamer waar de dieren in contact komen met het apparaat. Grondig veeg alle oppervlakken met een schone, droge papieren handdoek. Herhaal dit nog een keer en wacht 5 min. Initialiseren van de imaging station in stap 1.14.1. Verdoven de muis met een 300 pi mengsel dat 200 pl ketamine / xylazine en 100 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) door intraperitoneale injectie. Wacht 10 minuten na de injectie en bevestigen als de muizen volledig onder narcose door knijpen de staart. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "Auto" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de muizen op de beeldvorming statiop en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten. Zorg ervoor dat de tijd na de injectie is consistent met elke opnamesessie. Nadat het beeld met succes is overgenomen, moet een beeld raam en palet verschijnen. Klik op "ROI Tools" en selecteer "auto" van het icoon cirkel. Om ROI te definiëren, omringen het gebied van het signaal op de afbeelding, en neem dan de metingen van de ROI als eenheid van fotonen / sec / sr / cm2. Neem de muizen uit de beeldvorming kamer en het toezicht op de muizen totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Typisch hersteltijd is ongeveer 15 min. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. Monitor tumorgroei door bioluminescentie tweemaal per week totdat aanwezige dieren de volgende symptomen: gewichtsverlies (verlies van meer dan 20% van het gewicht vóór de implantatie), gebrek aan eetlust (complete anorexie voor 24 uur), en een gebrek aan duurzame purposeful respons op zachte stimuli (weak poging om omhoog), waarna ze moeten worden gedood. Euthanaseren dieren met deze symptomen met een CO 2 kamer, gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats muizen in de euthanasie kamer (niet overvol de kamer) en de instroom samengeperst CO 2 voor 5-6 min. Merk op dat alle dieren zijn bewusteloosheid en niet na ongeveer 5 min ademhalen. Neem de muizen uit de kamer. Zorg ervoor dat het hart niet klopt door het gevoel van de borst tussen duim en wijsvinger en controleer of er geen blink reflex. Weerhouden de muis in een buikligging op een vlakke ondergrond en het grijpen van de achterkant van de nek aan de basis van de schedel met de ene hand en de basis van de staart met uw duim en wijsvinger van de andere hand. Restrain het hoofd en snel de staart te trekken naar achteren. Zorg ervoor dat de schedel is gescheiden van de eerste halswervel met duim en wijsvinger. Normalize luminescentie waarden voor elke dag tegen corresponderende metingen verkregen bij de eerste dag van bioluminescentie als in stap 2,3 (Figuur 3A). Voor statistische analyse, het genereren van overlevingscurven met behulp van de Kaplan-Meier schatter 12 en vergelijk de verschillen tussen overlevingscurven met behulp van een log-rank test 13.