Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

Tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale uso di animali e del Comitato di cura presso la Northwestern University e sono stati condotti in condizioni sterili. 1. Modifica delle cellule GL261 con Firefly luciferasi Esprimendo Reporter NOTA: vettori lentivirali basati su HIV-1 esprimono luciferasi di lucciola (Fluc) sotto il controllo del promotore della milza fuoco formando virus (SFFV). Il gene reporter ottico è stato clonato nel vettore plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. Mantenere 293-T cellule modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e cellule GL261 in medium RPMI supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95 % di aria e 5% di anidride carbonica (CO 2). Quando la coltura cellulare 293-T raggiunge 80% di confluenza in un pallone T-75, lavare le cellule una volta con phtampone osphate salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 3 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato e raccogliere tutte le celle dal fondo della beuta. Trasferire il 3 ml di sospensione cellulare trypsinized in un tubo da 15 ml e aggiungere 7 ml di terreno RPMI carne (un totale di 10 ml della sospensione cellulare). Mescolare la sospensione cellulare bene con una pipetta da 5 ml. Prelevare 100 ml di sospensione cellulare dal tubo e contare il numero di cellule utilizzando emocitometro. Per fare ciò, mescolare 100 ml di sospensione cellulare con 300 ml di soluzione trypan blu e inserire 2 ml della miscela in un emocitometro. Contare il numero di cellule senza colorazione blu da quattro viste separate sotto un microscopio. In media il numero di cellule da ogni punto di vista, dato che questo numero rappresenta 10 4 cellule / ml. Nel frattempo, centrifugare la provetta contenente la sospensione cellulare a 300 xg per 7 minuti. Aspirare media e risospendere il pellet di cellule con mezzo fresco RPMI fare una sospensione cellulare GL261 a densità di 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 cellule GL261 con 2,5 ml di RPMI supporti in un pallone T-175 con 27,5 ml DMEM (giorno 1). Dopo 24 ore, sostituire il supporto con 20 ml di DMEM fresco (giorno 2). Per produrre il vettore lentivirale, mescolare 54 microlitri trasfezione reattivo con 2 ml di DMEM privo di siero per 5 min. Aggiungere 3 g di gag-pol, 3 mg di virus della stomatite vescicolare G busta (VSV-G), e 4,5 mg di Fluc (PSIN-Fluc) in DMEM con il reagente di trasfezione, e incubare per 20 minuti a RT. Eliminare la miscela DNA nella boccetta 293-T (T-175) e incubare a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 48 ore (giorno 2). Aggiungere 10 ml di DMEM fresco a 24 ore dopo la trasfezione (volume totale di 293-T terreno di coltura cellulare dovrebbe essere circa 30 ml) (giorno 3). Per dividere le celle in un GL26124 pozzetti, lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 5 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato , raccogliere tutte le cellule dal fondo del pallone, e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2. Nel frattempo, centrifugare la provetta a 300 xg per 7 minuti. Aspirare i media e sospendere nuovamente le pellet cellulari con fresco RPMI medio per effettuare una sospensione cellulare GL261 a densità di 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 cellule GL261 con 1 ml di media RPMI in una piastra da 24 pozzetti (giorno 3). Raccogliere 30 ml del supernatante lentivirale con 10 ml pipetta dal pallone 293-T (T-175) a 48 ore dopo la trasfezione e trasferire il surnatante in tubo da 50 ml. Aspirare il supernatante 30 ml lentivirale tramite una siringa da 50 ml, attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron, e il surnatante virale Aliquotare in 1 ml aliquote (giorno 4). Sostituire le 1 ml di RMedia PMI in piastra cellule GL261 (24 pozzetti) con 1 ml del supernatante lentivirale e incubare a 37 ° C in una camera umidificata (giorno 4). Dopo 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 6). Dopo 24 ore, ripetere l'infezione lentivirale delle cellule GL261 (giorno 7). Dopo il 2 ° 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 9). Continua a crescere le cellule GL261 luciferasi modificato (ad essere indicato come cellule GL261.luc) ed espandere la coltura cellulare in un pallone T-75. Quando la coltura cellulare GL261.luc raggiunge il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e contare da emocitometro come al punto 1.2. Piatto la cellula GL261.luc in una piastra da 24 pozzetti a densità di laurea (1,0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 cellule / pozzetto) e incubare a 37 ° C in un Humidicamera cato contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. Misurare cellulare attività luciferasi rispetto alla luciferasi modificato U-87 MG (U87.luc), le cellule utilizzando bioluminescenza (Figura 1). Avviare il software immagine (clic sull'icona sul desktop) e inizializzare il sistema di imaging (fare clic sul pulsante "inizializzare"). L'inizializzazione inizierà automaticamente e potrebbe richiedere diversi minuti per il sistema di check-up e la macchina fotografica di raffreddare fino a -90 ° C. Aggiungere 25 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) in tutti i pozzetti. Incubare le cellule con luciferina per 1 minuto a temperatura ambiente e immagine la piastra per 10 secondi. Per configurare il sistema di imaging, selezionare "luminescenti", "10 secondi" il tempo di esposizione, e binning "Medio". Posizionare la piastra 24 pozzetti sulla stazione di imaging e fare clic sul pulsante "Ripresa" per avviare l'immagine. Dopo che l'immagine viene acquisita con successo, si vedrà una finestra di immagine e strumento di palette sullo schermo. Fare clic su "ROI (regioni di interesse) Strumenti" e selezionare 6 x 4 dall'icona fessura. Creare 6 x 4 feritoie per coprire l'area del segnale sul immagine del 24-pozzetti e fare clic sulla scheda misure (icona della matita). Osservare una finestra con una tabella di misurazioni ROI come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato (fotoni / sec / sr / cm 2). Cellule uso U87.luc, in precedenza modificati con la stessa lentivirus usato qui per GL261 modifica 11, come un controllo per valutare l'attività della luciferasi in cellule GL261.luc trasdotte. 2. In Vitro proliferazione Assay Quando le colture cellulari e GL261 GL261.luc raggiungono il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere entrambe le linee cellulari mediante tripsinizzazione e contare come al punto 1.2, e cellule piastra in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1500 cellule 80 ml di terreno RPMI per pozzetto con una pipetta multicanale per minimizzare il tempo e l'errore pipettaggio. Seed ogni linea cellulare in totale 20 pozzi. Per limitare l'evaporazione nei pozzetti popolati da cellule, riempire pozzi vuoti con 100 ml di fresco media RPMI. Valutare la proliferazione cellulare utilizzando un test colorimetrico proliferazione cellulare. Qui usiamo il test proliferazione cellulare MTS. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 20 ml di reagente di MTS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente cellule. Incubare la piastra a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. Misurare l'assorbanza a 490 nm usando un lettore per micropiastre. Questo viene ripetuto nei giorni 1, 2, 4, e 7, dopo la placcatura. Per normalizzare valori di assorbanza, i valori di ogni giorno sono divisi per i corrispondenti letture ottenute al giorno 1 (Figura 2). 3. Tumore delle cellule impianto Nota: Autoclave tutte le attrezzature. Preparare area chirurgica spruzzando un disinfettante (soluzione di clorexidina al 2%) e coprire con absorbent tende. Al fine di mantenere condizioni di sterilità, indossare guanti chirurgici sterili durante l'intervento chirurgico, e dividere l'area chirurgica in due aree di nastro di colore. Area 1 è etichettato come "Clean" e contiene forniture sterilizzati; Area 2 è etichettato come "sporco" e contiene materiali utilizzati. Prima dell'intervento degli animali, preparare una sospensione di cellule per l'iniezione intracranica. Celle di raccolta da un confluenti 70% T-75 pallone mediante tripsinizzazione e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2, e fare una sospensione cellulare con una densità di 1,0 x 10 5 cellule / microlitro in soluzione salina bilanciata Hanks 'senza Ca 2+ e Mg 2+ (HBSS). Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di 200 microlitri miscela contenente 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina in soluzione fisiologica 0,9%. Per confermare il corretto anestesia, pizzicare la punta del mouse. Se il mouse è completamente sotto anestesia, il mouse non dovrebbe rispondere allo stimolo. Amministrare 0.1 mg / buprenorfina kg per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio. Radere la parte superiore della testa degli animali utilizzando tagliaunghie e pulito con un applicatore di cotone imbevuto di tip soluzione di clorexidina al 2%. Applicare pomata occhio per mantenere un'adeguata lubrificazione durante l'intervento chirurgico. Eseguire un'incisione sagittale lungo circa 1 cm sopra l'osso parieto-occipitale con un bisturi sterile. Per visualizzare il bregma, pulire la superficie del cranio con un applicatore di cotone-tip imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Forare il cranio con un ago sterile da 25 G a fare un piccolo foro 3 mm a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. Per assicurarsi che il sito di iniezione intracranica è ad una profondità di 3 mm dal cranio, tagliato 3 mm da estremità appuntita di un puntale di 20 microlitri con le forbici e inserire una siringa nella punta della pipetta. Inserire la siringa perpendicolarmente al foro creato in precedenza, e iniettare lentamente il sus cellule tumoralipensione contenente 3.0 x 10 5 cellule in 3 ml HBSS, per un periodo di 1 min. Lasciare l'ago in posizione per un altro minuto, e poi estrarre lentamente l'ago. Tampone cranio con applicatore cotone imbevuto di punta 3% di perossido di idrogeno e la soluzione di clorexidina 2%. Asciugare la superficie del cranio con l'applicatore di cotone-punta. Tagliare la cera ossea sterile circa 3 mm 3 dimensioni e fissare la cera ossea sul lato dell'estremità dell'applicatore cotone punta. Applicare la cera osso per coprire il buco con l'applicatore di cotone-punta. Disegnare il ciascun lato del cuoio capelluto insieme sul cranio con pinze, e fiocco per chiudere la ferita. Pulire la ferita con un batuffolo di cotone imbevuto di punta soluzione di clorexidina al 2%. Monitorare tutti i mouse dopo l'intervento fino a quando diventano ambulatoriale e mantenere la normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. <p class = "jove_title"> 4. Bioluminescenza della crescita tumorale GL261 Spruzzare una generosa quantità di disinfettante (soluzione di dimetil cloruro di ammonio 0,05%) su un tovagliolo di carta pulito. Utilizzare il tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante-per pulire a fondo il foglio nero, coni naso e divisorio all'interno della camera di imaging dove gli animali saranno in contatto con il dispositivo. Pulire accuratamente tutte le superfici con un fazzoletto di carta pulito e asciutto. Ripetere questo ancora una volta e attendere 5 minuti. Inizializzare la stazione di imaging come al punto 1.14.1. Anestetizzare il mouse con una miscela di 300 ml contenente 200 ml di ketamina / xilazina e 100 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. Attendere 10 minuti dopo l'iniezione e confermare se i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare la coda. Per configurare il sistema di imaging, selezionare "luminescenti", tempo di esposizione "Auto", e binning "Medio". Mettere i topi sulla ferr immaginisu e fare clic sul pulsante "Ripresa" per avviare l'immagine. Verificare che il tempo dopo l'iniezione è coerente con ogni sessione di imaging. Dopo che l'immagine viene acquisita con successo, dovrebbe apparire una finestra di immagine e tavolozza degli strumenti. Fare clic su "Strumenti ROI" e selezionare "auto" dall'icona cerchio. Per definire ROI, circondare la zona del segnale dell'immagine, e poi prendere le misure del ROI come unità di fotoni / sec / sr / cm 2. Prendere i topi dalla camera di imaging e monitorare i topi fino a diventare ambulatoriale e mantenere l'attività normale. In genere il tempo di recupero è di circa 15 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. Monitorare la crescita tumorale di imaging bioluminescenza due volte a settimana fino a quando gli animali presentano i seguenti sintomi: perdita di peso (perdita di oltre il 20% rispetto al peso prima dell'impianto), inappetenza (anoressia completa per 24 ore), e la mancanza di purposefu sostenutarisposta a stimoli l dolce (debole tentativo di alzarsi), momento in cui devono essere eutanasia. Euthanize animali con questi sintomi utilizzando una camera di CO 2 seguita da dislocazione cervicale. Topi posto nella camera di eutanasia (fare non sovraffollate della camera) e afflusso compressi di CO 2 per 5-6 min. Osservare che tutti gli animali sono incoscienza e non respira dopo circa 5 min. Prendere i topi dalla camera. Assicurarsi che il cuore non batte per sentire il petto tra il pollice e l'indice e controllare che non vi è alcun riflesso corneale. Trattenere il mouse in posizione prona su una superficie piana e afferrare la parte posteriore del collo alla base del cranio, con una mano e base della coda con il pollice e l'indice dell'altra mano. Trattenere la testa e tirare rapidamente la coda all'indietro. Assicurarsi che il cranio è separato dalla prima vertebra cervicale con il pollice e l'indice. Normaalize valori di luminescenza per ogni giorno contro letture corrispondenti ottenuti al primo giorno dell'imaging bioluminescenza come al punto 2.3 (Figura 3A). Per l'analisi statistica, generare curve di sopravvivenza utilizzando lo stimatore di Kaplan-Meier 12 e confrontare le differenze tra le curve di sopravvivenza con un log-rank test 13.